Антитела igg к цитомегаловирусу cmv: Антитела к Cytomegalovirus, IgG (иммуноблот)

Спасибо за письмо.

Продукт, который я определил для вас, выглядит следующим образом;

ab108776
ab108778

ab108767
мы не против краснухи IgM Комплект

ab108724
ab108725

ab108737
ab108738

ab108739
ab108740

ab108742

Я связался со своим коллегой, который даст вам объемную цитату для этот комплект.Пожалуйста, дайте мне знать, если вы не получите от нас ответа в течение 24 часов с момента получения этого письма.

Надеюсь, эта информация будет вам полезна. Если вам потребуется дополнительная информация, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться ко мне.

Спасибо за ваш запрос.

Я рад подтвердить, что планшеты ab108724 покрыты антигенами штамма CMV AD-169.

Надеюсь, эта информация окажется полезной. Пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к ним снова с любыми дополнительными вопросами.

A1: ИФА ЦМВ, ab108724, является качественным и поэтому не имеет известного предела обнаружения.Чувствительность анализа определяется как вероятность положительного результата анализа в присутствии определенного аналита. Чувствительность анализа для этого набора составляет 98%. A2: Контроль отсечки используется для определения порога оптической плотности, при котором образцы считаются положительными или отрицательными. Подробнее об этом расчете см. на вкладыше к продукту. A3: Элементы управления в этом наборе поставляются в жидкой форме, готовые к использованию.

Спасибо за терпение.Лаборатория, разработавшая ИФА, прислала следующую информацию. Если это не полностью отвечает на ваши вопросы, пожалуйста, свяжитесь со мной. CMV IgG ELISA – это качественный тест. Поэтому у нас нет данных о пределе обнаружения или всплесках. Тепловая инактивация образцов не рекомендуется, так как это отрицательно влияет на результаты испытаний. Перекрестной реактивности с антителами против HSV1-2, кори, эпидемического паротита или VZV не наблюдалось. Специфичность диагностики определяется как вероятность отрицательного результата анализа при отсутствии специфического аналита.Для этого он составляет 97,5%. Диагностическая чувствительность определяется как вероятность положительного результата анализа в присутствии определенного аналита. Чувствительность этого анализа составляет 98%. Интерференция с гемолитической, липемической или желтушной сыворотками не наблюдается до концентрации гемоглобина 10 мг/мл, триглицеридов 5 мг/мл и билирубина 0,2 мг/мл.

Цитомегаловирус IgG Avidity

Авидность цитомегаловируса IgG

Лаборатория коммерческой рассылки
5231 РКП
356-8593

Носитель коллекции:

Минимум:

Предпочтительный минимум: 0.5 мл сыворотки
Абсолютный минимум: 0,15 мл сыворотки

Инструкции по доставке:

Повернуться Время:

1-8 дней при поступлении в референс-лабораторию

Диапазон задания:

0,50 Индекс или меньше: низкая авидность
0,51-0,59 Индекс: Промежуточная авидность
Индекс 0,60 или выше: High Avidity

Данные интерпретации:

Выявление ЦМВ-инфекции у беременных при первом триместр имеет большое значение для клинической помощи. Острый Инфекция обычно характеризуется повышенным содержанием IgM, специфичных к ЦМВ, и антитела IgG. Однако антитела IgM ЦМВ могут сохраняться в течение нескольких месяцев или даже лет после первоначального заражения, что ограничивает их полезность в точной диагностике недавней ЦМВ-инфекции. ЦМВ IgM антитела также могут быть обнаружены во время реактивации вируса, таким образом осложняет диагностику недавней первичной инфекции. Следовательно, измерение авидности антител IgG к антигенам ЦМВ может помочь в отличить недавнюю ЦМВ-инфекцию от предшествующей.Значение индекса 0,5 или реже указывают на недавнюю инфекцию (в течение предыдущих 3-х до 4 месяца). Однако низкие значения авидности не могут исключать возможности персистентных IgG-антител с низкой авидностью. Значения индекса 0,6 или больше указывает на инфекцию, возникшую более чем за 3 месяца до тестирование. Поскольку тестирование авидности IgG на ЦМВ после первого триместра не легко интерпретируется, обнаружение высокоавидных CMV IgG антитела в первом триместре (12-16 недель беременности) помогают исключить диагноз острой ЦМВ-инфекции после зачатия.

Комментарии:

Различие между недавним (первичным) и перенесенным цитомегаловирусом (ЦМВ) инфекция может быть важным инструментом в клиническом лечении реципиенты трансплантатов и беременные женщины. Хотя почти все лица с недавней инфекцией ЦМВ положительны на ЦМВ IgM, люди с ЦМВ в прошлом могут также экспрессировать ЦМВ IgM после вирусного реактивация; таким образом, обнаружение CMV IgM не является надежным индикатором недавней инфекции.Измерение авидности CMV IgG может помочь в отличить недавнюю ЦМВ-инфекцию от прошлой. Несмотря на низкую жадность индекс является надежным показателем инфицирования ЦМВ в течение предшествующих 6 лет. месяцев, высокий индекс авидности более значим с клинической точки зрения. точка зрения; высокий индекс авидности практически исключает возможность что заражение произошло в течение предыдущих 4 месяцев.

Таким образом, оценка авидности IgG, специфичных к цитомегаловирусу, чрезвычайно важна. мощный инструмент для оценки времени инфицирования ЦМВ.Такой информация особенно важна для клинического ведения беременных женщин, у которых впервые обнаружены антитела к цитомегаловирусу. предродовой визит. Определение времени первичного заражения может помочь принимать решения относительно противовирусной терапии, выявляя таких женщин кто должен или не должен лечиться во время беременности. Авидность IgG цитомегаловируса измерение также имеет широкое применение для управления другими группы пациентов с повышенным риском изнурительной ЦМВ-инфекции, таких как реципиенты трансплантатов паренхиматозных органов.Примерно 50% беременных женщин с первичной ЦМВ-инфекцией передают ЦМВ своим детям. Измерение авидности CMV IgG позволяет надежно отличить первичную инфекцию от активной латентной инфекции во время беременности.

Методология:

Полуколичественный твердофазный иммуноферментный анализ

Анализ крови на ЦМВ

Определение

adam.com»> Анализ крови на ЦМВ определяет наличие в крови веществ (белков), называемых антителами к вирусу, называемому цитомегаловирусом (ЦМВ).

Альтернативные названия

Тесты на антитела к ЦМВ

Как проводится тест

Необходим образец крови.

Как подготовиться к тесту

Специальной подготовки к тесту нет.

Ощущения при проведении теста

При введении иглы для забора крови некоторые люди чувствуют умеренную боль, в то время как другие ощущают только укол или покалывание. После этого может быть некоторая пульсация или небольшой синяк. Это скоро проходит.

Зачем проводится тест

ЦМВ-инфекция — это заболевание, вызываемое одним из типов вируса герпеса.

Анализ крови на ЦМВ проводится для выявления текущей активной ЦМВ-инфекции или перенесенной ЦМВ-инфекции у людей, подверженных риску реактивации инфекции. К таким людям относятся реципиенты трансплантированных органов и люди с подавленной иммунной системой. Тест также может быть выполнен для выявления ЦМВ-инфекции у новорожденных.

Нормальные результаты

Люди, которые никогда не были инфицированы ЦМВ, не имеют обнаруживаемых антител к ЦМВ.

Диапазоны нормальных значений могут незначительно различаться в разных лабораториях.Некоторые лаборатории используют разные измерения или тестируют разные образцы. Поговорите со своим лечащим врачом о значении ваших конкретных результатов теста.

Что означают ненормальные результаты

Наличие антител к ЦМВ указывает на текущую или перенесенную инфекцию ЦМВ. Если количество антител (называемое титром антител) повышается в течение нескольких недель, это может означать, что у вас текущая или недавняя инфекция.

Долгосрочная (хроническая) ЦМВ-инфекция (при которой количество антител остается примерно одинаковым с течением времени) может реактивироваться у человека с подавленной иммунной системой.

Риски

Взятие крови сопряжено с небольшим риском. Вены и артерии различаются по размеру от одного человека к другому и от одной стороны тела к другой. Взять кровь у одних людей может быть сложнее, чем у других.

Другие риски, связанные с забором крови, незначительны, но могут включать:

• Чрезмерное кровотечение
• Обморок или ощущение головокружения
• Множественные проколы для обнаружения вен
• Гематома (кровь, скопившаяся под кожей)
каждый раз, когда кожа повреждена)

Соображения

Чтобы обнаружить инфекцию крови или органов, вызванную ЦМВ, поставщик может проверить наличие самого ЦМВ в крови или конкретном органе.

Каталожные номера

Britt WJ. Цитомегаловирус. В: Bennett JE, Dolin R, Blaser MJ, ред. Принципы и практика инфекционных болезней Манделла, Дугласа и Беннета . 9-е изд. Филадельфия, Пенсильвания: Elsevier; 2020: глава 137.

Мазур Л.Дж., Костелло М. Вирусные инфекции. В: Макферсон Р.А., Пинкус М.Р., ред. Клиническая диагностика Генри и лечение с помощью лабораторных методов . 23-е изд. Сент-Луис, Миссури: Elsevier; 2017: глава 56.

Frontiers | Протективный цитомегаловирусный (ЦМВ)-специфический Т-клеточный иммунитет часто встречается у пациентов с трансплантацией почки без антител к ЦМВ в сыворотке

Введение

Реципиенты трансплантата почки (КТ) подвергаются повышенному риску инфекций после трансплантации, одной из основных угроз является цитомегаловирус (ЦМВ).Первичная инфекция или реактивация ЦМВ может вызвать виремию и привести к тяжелому ЦМВ заболеванию с поражением органов (1). Пациенты с повышенным риском инфекции ЦМВ получают либо профилактическую, либо упреждающую противовирусную терапию (валганцикловир) после трансплантации почки (2). Классификация риска ЦМВ-инфекции перед КТ основана на наличии у пациента анти-ЦМВ-иммуноглобулина G (IgG) в сочетании с ЦМВ-серостатусом донора почки. Иммунитет к вирусам, например, ЦМВ, зависит от адекватной помощи со стороны ЦМВ-специфичных CD4 ⁺ Т-клеток, обеспечивающих выработку нейтрализующих антител ЦМВ-специфическими В-клетками/бластами плазмы и эффективных цитотоксических CD8 ⁺ Т-клеток (CTL). ) ответы (3–5).Отсутствие нейтрализующих антител не обязательно означает, что антиген ранее не встречался, так как клеточный иммунитет все еще может присутствовать. Кроме того, известно, что у больных с терминальной стадией почечной недостаточности (ТХПН) протективный гуморальный иммунитет не поддерживается и часто не достигается (6, 7). Поэтому несколько групп предложили включить оценку клеточного иммунитета против ЦМВ в стратегию оценки риска для более точной оценки сенсибилизации перед трансплантацией (8–10).Данных о том, защищает ли наличие ограниченного клеточного иммунитета от виремии ЦМВ после трансплантации почки, недостаточно, и нет подробных сведений о том, какие подмножества Т-клеток участвуют в достаточной защите, поскольку клеточный иммунитет в основном оценивается с помощью ELISpot (11). .

Дифференцировку Т-клеток можно оценить с помощью экспрессии CD45RO или CD45RA и хемокинового рецептора CCR7 самонаведения лимфатических узлов, который способен идентифицировать наивные Т-клетки и различные подмножества Т-клеток памяти, т.е.е., центральная память (CM), эффекторная память (EM) и, наконец, терминально дифференцированная EM CD45RA ⁺ (EMRA) (12). Это сопровождается потерей костимулирующего маркера CD28. В частности, эффективный ЦМВ-специфический Т-клеточный ответ дает много высокодифференцированных CD28 ^{нулевых} Т-клеток (13, 14). Как мы показали ранее, этот Т-клеточный ответ усиливает иммунологическое старение Т-клеток, наблюдаемое в кровотоке пациентов с терминальной почечной недостаточностью, что приводит к сдвигу в сторону более дифференцированных Т-клеток памяти и усиленному истощению теломер (14, 15).Неизвестно, влияет ли наличие ограниченного клеточного иммунитета к ЦМВ на характеристики старения Т-клеток у пациентов с тХПН.

Целью данного исследования является оценка ЦМВ-специфического Т-клеточного иммунитета, включая стадию дифференцировки ЦМВ-специфических Т-клеток, и определение его клинической значимости в отношении защиты от ЦМВ-виремии после трансплантации в когорте ЦМВ-серонегативных пациентов. Кроме того, оценивалось влияние на параметры старения Т-клеток.

Материалы и методы

Исследуемая группа

В когорте стабильных ЦМВ-серонегативных и, в качестве контроля, сопоставимых по возрасту и полу ЦМВ-серопозитивных реципиентов почки от ЦМВ-серопозитивного донора (D ⁺ /R ⁻ и D ⁺ / R ⁺ соответственно), ЦМВ-специфический иммунитет оценивали до трансплантации и связывали с ЦМВ-виремией после КТ.Большинство пациентов (86%) получали индукционную терапию базиликсимабом (Simulect ^® , Novartis). Стандартная тройная иммуносупрессия, назначаемая после трансплантации, состояла из такролимуса (Prograf ^® , Astellas Pharma), микофенолата мофетила (Cellcept ^® , Roche) и преднизолона (первые 3 месяца после КТ); последние два для всех пациентов. Первые 6 месяцев после трансплантации противовирусная профилактика валганцикловиром 450 мг 1 раз в сутки.д. давали и при необходимости корректировали в связи с нарушением функции почек. Характеристики пациентов перечислены в таблице 1. Все пациенты дали письменное информированное согласие на участие в этом исследовании. Исследование было одобрено Комитетом по медицинской этике Erasmus MC (номер METC 2010-080) и проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией и Стамбульской декларацией.

Таблица 1 . Демографические и клинические характеристики изучаемой популяции.

Обнаружение виремии ЦМВ и ЦМВ-специфических антител

Сывороточные антитела IgG к ЦМВ [выраженные в условных единицах/мл (AU/мл)] измеряли с помощью иммуноферментного анализа (Biomerieux, VIDAS, Лион, Франция).Результат ≥6 AU/мл считался положительным. В течение первого года после трансплантации пациентов контролировали с интервалом в 3 месяца на наличие ДНК ЦМВ. Диагноз ЦМВ-виремического эпизода основывался на наличии копий [выраженных в международных единицах/мл (МЕ/мл)] ДНК ЦМВ в крови и устанавливался количественной полимеразной цепной реакцией в отделении вирусологии МЦ Эразмус. Результат >50 МЕ/мл свидетельствовал о виремии ЦМВ.

Изоляция периферических мононуклеарных клеток (МКПК)

До КТ РВМС выделяли, как подробно описано ранее (16), из гепаринизированных образцов крови, взятых у ЦМВ-серонегативных и ЦМВ-серопозитивных пациентов, и хранили по 10 миллионов РВМС во флаконе при -150°C до дальнейшего использования.

Обнаружение ЦМВ-специфических CD137-экспрессирующих цитокин-продуцирующих Т-клеток

Периферические мононуклеарные клетки 28 ЦМВ-серонегативных и 14 ЦМВ-серопозитивных пациентов размораживали, оставляли на 8 ч при 37°C и стимулировали (5 × 10 ⁶ РВМС/мл) в RPMI-1640, содержащем глутамакс (GibcoBRL, Пейсли, Шотландия) с добавлением 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% объединенной сыворотки человека, инактивированной нагреванием, далее называемой стандартной культуральной средой. Стимуляцию проводили в полистироловых пробирках (BD Pharmingen, Erembodegem, Бельгия) в присутствии костимуляции CD49d (1 мкг/мл; BD) без (фона) или со смесью перекрывающихся пулов пептидов, охватывающих весь pp65 и IE-1. белок ЦМВ (1 мкг/мл; PepTivator-CMV pp65 и IE-1; Miltenyi Biotec GmbH, Бергиш-Гладбах, Германия) и брефельдин А (Golgiplug; BD Pharmingen) в течение 12 ч.Этот анализ внутриклеточного окрашивания цитокинов облегчает детальную характеристику CMV-специфических CD4 ⁺ , а также CD8 ⁺ Т-клеток, поскольку они могут быть идентифицированы по экспрессии de novo CD137 в сочетании с эффекторными молекулами (17). В качестве положительного контроля РВМС 10 ЦМВ-серонегативных и 5 ЦМВ-серопозитивных пациентов стимулировали комбинацией ацетата форболмиристата (ФМА; 50 нг/мл; Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и иономицина (1 мкг). /мл; Sigma Aldrich) и обработаны, как описано ранее.

Затем было выполнено поверхностное окрашивание для идентификации наивных (CD45RO ^— CCR7 ⁺ ) и субпопуляций Т-клеток памяти (12). Т-клетки CM представляют собой CD45RO ⁺ CCR7 ⁺ , эффекторную память (EM) CD45RO ⁺ CCR7 ^— и терминально дифференцированную эффекторную память (EMRA) CD45RO ^— CCR7 ^— . Кроме того, все более и более дифференцированные подмножества Т-клеток также были идентифицированы по CD28 (т. е. менее дифференцированные, имеющие CD28 ⁺ , и более дифференцированные, лишенные CD28, обозначенные как CD28 ^null ).Использовали следующие моноклональные антитела: анти-CD4, меченые бриллиантовым фиолетовым (BV)-510 (Biolegend Europe BV, Uithoorn, Нидерланды), анти-CD45RO, меченые синим пацификом (Biolegend), аллофикоцианин-Cy7 (APC-Cy7)- меченные анти-CD8 (BD, Erembodegem, Бельгия), анти-CD28, меченные перидинином хлорофилл-Cy5.5 (PerCP-Cy5.5) (BD), и анти-CCR7, меченные фикоэритрин-Cy7 (PE)-Cy7 (BD ). После фиксации и пермеабилизации клетки окрашивали внутриклеточно с использованием анти-CD137, меченного APC (BD), и анти-IFNγ, меченного PE (BD Pharmingen).Клетки, продуцирующие ИЛ-2, оценивали только у части протестированных пациентов, то есть у 12 ЦМВ-серонегативных и 6 ЦМВ-серопозитивных пациентов, путем совместного внутриклеточного окрашивания с использованием анти-ИЛ-2 (BD), меченного изотиоцианатом флуоресцеина. Образцы измеряли на FACSCanto II (BD Pharmingen) с целью получения 0,5–1 × 10 ⁶ Т-клеток и анализировали с использованием программного обеспечения FACSDiva версии 6.1.2 (BD). Стратегия гейтирования для выявления CMV-специфических CD137 ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток в различных подмножествах и в сочетании с продукцией цитокинов показана на рисунке S1 в дополнительном материале, аналогичный подход применялся для CD8 ⁺ Т-клеток.Медиана (диапазон IQ) для CD137-экспрессирующих CD4 ⁺ Т-клеток всех образцов составила 0,05% (0,03–0,07%), тогда как для CD137-экспрессирующих CD8 ⁺ Т-клеток она была выше и составила 0,44% (0,03–0,07%). 0,23–1,02%). Среднее фоновое значение для CD137 ⁺ IFNγ ⁺ CD4 ⁺ и CD8 ⁺ и CD137 ⁺ IL-2 ⁺ CD4 ⁺ T-клеток всех образцов были ), 0,04% (0–0,09%) и 0,01% (0,01–0,01%) соответственно.Большая часть фонового сигнала в Т-клетках CD4 ⁺ наблюдалась в клетках, коэкспрессирующих CD28 и имеющих фенотип CM/EM, тогда как в клетках, наблюдаемых для Т-клеток CD8 ⁺ , преобладало отсутствие CD28 и фенотип EM/EMRA. Поскольку частоты, полученные для различных параметров, значительно различались среди пациентов, мы вычли нестимулированное значение для каждого пациента из значения после стимуляции пептидом ЦМВ, чтобы рассчитать чистый сигнал, как показано в результатах. Положительный поддающийся обнаружению ЦМВ-специфический ответ определяли, если чистый ответ превышал 0.Только определяемые CD4 ⁺ и CD8 ⁺ CD137 ⁺ CMV-специфические Т-клеточные ответы были проанализированы более подробно в отношении продукции цитокинов и фенотипических аспектов.

Обнаружение ЦМВ-специфических пролиферирующих Т-клеток

Периферические мононуклеарные клетки 12 ЦМВ-серонегативных и 6 ЦМВ-серопозитивных пациентов были разморожены и помечены сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеиндиацетата в соответствии с инструкциями производителя (CFSE; Molecular Probes ^® , Нидерланды) и впоследствии стимулированы в трех экземплярах в стандартной культуральной среде. при 5 × 10 ⁴ на лунку (96 лунок — планшет с круглым дном) без или с лизатом ЦМВ (30 мкг/мл; Microbix Biosystems Inc., ON, Канада) или смесью перекрывающихся пептидных пулов, охватывающих весь белок pp65 и IE-1 CMV (оба в конечной концентрации 1 мкг/мл; PepTivator-CMV pp65 и IE-1; Miltenyi Biotec). Стимуляция лизатом ЦМВ может позволить охарактеризовать общий пул ЦМВ-специфических CD4 ⁺ Т-клеток, поскольку пулы перекрывающихся пептидов охватывают только два (хотя и доминирующих) пептида белка ЦМВ. Пролиферацию CMV-специфических CD8 ⁺ Т-клеток анализировали только после стимуляции перекрывающимися пулами пептидов pp65 и IE-1, а не целым лизатом CMV из-за их ограничения по длине (количеству аминокислот) пептидов, представленных в контекст HLA класса I.Через 6 дней клетки собирали, окрашивали с использованием моноклональных антител, направленных против CD3, CD4, CD8 и CD28 (опять же для выявления менее дифференцированных по сравнению с более дифференцированными субпопуляциями среди пролиферирующих Т-клеток), и мертвые клетки исключали с помощью 7-аминоактиномицина D. Образцы были измерены на FACSCanto II (BD) и проанализированы с использованием программного обеспечения FACS Diva версии 6.1.2 (BD), процент CMV-специфичных пролиферирующих Т-клеток рассчитывали путем вычитания процентного содержания Т-клеток, пролиферирующих в отсутствие этих стимулов.Медиана (диапазон IQ) пролиферирующих CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клеток в отсутствие стимула составила 0,83% (0,50–2,48%) и 1,42% (0,69–3,36%) соответственно. Положительный обнаруживаемый ответ определялся, если чистый ответ превышал 0,

Суммарные и CMV-специфические клетки, секретирующие антитела IgG (ASC)

Периферические мононуклеарные клетки 11 ЦМВ-серонегативных и, в качестве положительного контроля, 4 ЦМВ-серопозитивных пациентов размораживали и впоследствии стимулировали при плотности 2 × 10 ⁶ /мл в течение 5 дней с R848 и рекомбинантным IL-2, согласно инструкции производителя (U-Cytech BV, Утрехт, Нидерланды).На 4-й день лунки 96-луночного планшета покрывали на ночь при 4°С в соответствии с инструкцией производителя. Покрытие состояло либо из антитела против человеческого IgG для подсчета общего IgG ASC, либо из лизата ЦМВ (30 мкг/мл Microbix Biosystems Inc., ON, Канада) для подсчета CMV-специфических IgG ASC. После стимуляции клетки собирали, подсчитывали и добавляли в планшет ELISpot с покрытием в различных концентрациях, каждую в трех экземплярах. После 7-часовой инкубации (37°C, 5% CO ₂ ) клетки лизировали, а дебрис удаляли с помощью PBS/0.05% Твин-20. Затем лунки планшета ELISpot инкубировали в течение 1 ч при 37°C с биотинилированным антителом против IgG человека (обнаружение) и после промывки инкубировали с phi-меченым антителом против биотина (ГАМК) в течение 1 ч при 37°C. С. Наконец, ASC визуализировали после процедуры промывки с использованием активационного раствора (U-Cytech BV), что приводило к осадку серебра при инкубации в темноте при комнатной температуре. Развитие окраски останавливали с помощью диионизированной воды и подсчитывали пятна с помощью считывателя ELISpot (Bioreader ^® -600V, BIO-SYS GmbH, Карбен, Германия). CMV-IgG ASC выражены как количество/10 ⁵ клеток и частота общего IgG ASC.

В дополнение к анализу ASC образец до и после стимуляции был проанализирован на образование бластов В-клеток с помощью проточной цитометрии. Использовалась следующая панель моноклональных антител: анти-CD19, меченое BV510 (Biolegend), анти-CD38, меченное BV421 (BD), и анти-CD27, меченное PE-Cy7 (eBioscience). Взрывы плазмы были CD19 ⁺ CD38 ^{высокий} CD27 ⁺ .

Абсолютное количество CD4

Абсолютное количество подмножеств Т-клеток (18) и статус дифференцировки Т-клеток (19) определяли с помощью окрашивания цельной крови, как подробно описано ранее.

Анализ длины теломер

Относительную длину теломер CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клеток определяли с помощью Flow fluorescent гибридизации in situ (flow-FISH), как описано ранее (15, 20).

Статистический анализ

Статистический анализ выполнен с использованием GraphPad Prism версии 5.01. Непараметрический критерий Манна-Уитни U или критерий Крускала-Уоллиса с последующим апостериорным анализом (критерий множественных сравнений Даннса).Категориальные переменные сравнивались с использованием точного критерия Фишера. Для оценки ассоциаций между различными параметрами использовали непараметрический коэффициент ранговой корреляции Спирмена (ро Спирмена, R с). P — значения <0,05 для двух сторон считались статистически значимыми.

Результаты

Изучение характеристик популяции

Демографические и клинические характеристики исследуемой популяции представлены в таблице 1. В исследование были включены 28 ЦМВ-серонегативных и 14 ЦМВ-серопозитивных пациентов того же возраста и пола.Обе группы были хорошо сопоставимы без существенных различий в клинических характеристиках. Приблизительно у половины ЦМВ-серонегативных пациентов по сравнению с ни одним из ЦМВ-серопозитивных пациентов не наблюдалось ЦМВ-виремии в течение 12 месяцев после трансплантации ( P < 0,01).

ЦМВ-серонегативные пациенты часто имеют ЦМВ-специфические Т-клетки

Цитомегаловирус-специфические CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки, идентифицированные по экспрессии CD137 при стимуляции пептидным пулом двух иммунодоминантных белков pp65 и IE-1 (CD137 ⁺ CD4 ⁺ и CD137 ⁺ CD8 ⁺ ) присутствовали у 16 ​​из 28 ЦМВ-серонегативных пациентов.Медиана (диапазон IQ) положительных ответов составила 0,03% (0,01–0,11%) и 0,10% (0,03–0,18%) для Т-клеток CD4 ⁺ и CD8 ⁺ соответственно (рис. 1А, С, черный цвет). точки). Положительная корреляция наблюдалась между уровнями CD4 ⁺ и CD8 ⁺ ЦМВ-специфического Т-клеточного ответа у ЦМВ-серонегативных пациентов ( R с = 0,50, P < 0,05). Процент CMV-специфических CD137-позитивных CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клеток (присутствующих у 14 и 11 из 14 ЦМВ-серопозитивных пациентов соответственно) был значительно ( P < 0. 001) выше у ЦМВ-серопозитивных пациентов и составляли 0,61% (0,11–1,04%) и 1,45% (0,44–8,69%) (рис. 1А, С, светлые точки) соответственно.

Рисунок 1 . Цитомегаловирус (CMV)-специфические Т-клетки, экспрессирующие CD137 и продуцирующие цитокины. Периферические мононуклеарные клетки пациентов стимулировали в течение 12 часов в присутствии брефельдина А и αCD49d по отдельности или в смеси пулов перекрывающихся пептидов ppp65 и IE-1. Затем клетки окрашивают клеточной поверхностью и внутриклеточно, чтобы определить частоты и фенотипические характеристики CMV-специфических Т-клеток, экспрессирующих CD137, а также клеток, продуцирующих цитокины.CMV-специфические CD137-экспрессирующие CD4 ⁺ (A) и CD8 ⁺ (C) Т-клетки, с поправкой на фон (только αCD49d), представлены в процентах от общего числа CD4 ⁺ или CD8 ⁺ Т-клетки и нескорректированные значения принимают за 100% и препарируют на CD4 ⁺ (B) или CD8 ⁺ (D) Т-клетки, коэкспрессирующие или лишенные CD28, и различные наивные Т-клетки и Т-клетки памяти подмножества ячеек. Аналогичный подход применяется для CMV-специфических CD137-экспрессирующих IFN-γ и IL-2-продуцирующих CD4 ⁺ [ (E,G) и рассечение в (F,H) ] и CD8 ⁺ [ (I) и рассечение на панели (J) ] Т-клеток соответственно.Закрытые и открытые символы/столбцы представляют ЦМВ-серонегативных (с обнаруживаемым ответом) и ЦМВ-серопозитивных пациентов, соответственно, а столбцы отображают медианы и межквартильный диапазон групп пациентов. * Р < 0,05; ** Р < 0,01, *** Р < 0,001.

Цитомегаловирус-специфические CD137 ⁺ CD4 ⁺ и CD137 ⁺ CD8 ⁺ Т-клетки имели преимущественно фенотип памяти как у ЦМВ-серопозитивных, так и у ЦМВ-серонегативных пациентов.Однако значительно более высокие проценты ( P <0,05) CD137 ⁺ CD4 ⁺ и CD137 ⁺ CD8 ⁺ Т-клеток у ЦМВ-серонегативных пациентов имели наивный фенотип по сравнению с ЦМВ-серопозитивными пациентами (рис. 1Б,Г соответственно). Никаких различий не наблюдалось при сравнении максимальной способности Т-клеток экспрессировать CD137 между ЦМВ-серонегативными и ЦМВ-серопозитивными пациентами при стимуляции PMA/иономицином (рисунки S2A, B в дополнительных материалах).

ЦМВ-специфические Т-клетки у ЦМВ-серонегативных пациентов продуцируют IFNγ и IL-2

Затем было изучено присутствие и распределение IFNγ- и IL-2-продуцирующих Т-клеток, специфичных для ЦМВ. У 13 из 28 ЦМВ-серонегативных пациентов присутствовали ЦМВ-специфические IFNγ ⁺ CD137 ⁺ CD4 ⁺ Т-клетки, а медиана (диапазон IQ) частот составила 0,01% (0,01–0,04%) по сравнению с 0,58% ( 0,16–0,87%) для ЦМВ-серопозитивных пациентов, все из которых имели ЦМВ-специфический IFNγ ⁺ CD137 ⁺ CD4 ⁺ Т-клетки (рис. 1E, P < 0.001). У ЦМВ-серонегативных пациентов примерно 37% ЦМВ-специфических CD137-экспрессирующих CD4 ⁺ Т-клеток продуцировали IFNγ по сравнению с 69% у ЦМВ-серопозитивных пациентов ( P < 0,05). IFNγ-продуцирующие CMV-специфические CD137 ⁺ CD4 ⁺ Все Т-клетки коэкспрессировали CD28, и сходные частоты присутствовали в подгруппах CM и EM у CMV-серонегативных пациентов. У ЦМВ-серопозитивных пациентов наблюдался несколько более дифференцированный фенотип — 16% ( P < 0.01) этих клеток отсутствовал CD28, и 75% были классифицированы как Т-клетки ЭМ (рис. 1F).

У 12 ЦМВ-серонегативных и 6 ЦМВ-серопозитивных пациентов была оценена частота IL-2-продуцирующих CD4 ⁺ Т-клеток, специфичных для ЦМВ, поскольку мы ранее показали, что они связаны с титрами анти-ЦМВ IgG (6). CMV-специфические CD137 ⁺ CD4 ⁺ IL-2 ⁺ Т-клетки были обнаружены у 9 из 12 (75%) ЦМВ-серонегативных пациентов по сравнению со всеми ЦМВ-серопозитивными пациентами, а медиана (диапазон IQ) частот составила до 0.01% (0,01–0,01%) и 0,26% (0,01–0,87%) для ЦМВ-серонегативных и ЦМВ-серопозитивных пациентов ( P <0,05; рисунок 1G). Сорок процентов ЦМВ-специфических CD137-экспрессирующих CD4 ⁺ Т-клеток ЦМВ-серонегативных пациентов продуцировали ИЛ-2 по сравнению с 37% ЦМВ-серопозитивных пациентов. У ЦМВ-серонегативных пациентов почти все ИЛ-2-продуцирующие клетки коэкспрессировали CD28, в отличие от наличия CD28 ^{нулевых} ЦМВ-специфических ИЛ-2-продуцирующих клеток (10%) в ЦМВ-серопозитивной группе ( P < 0.01; Рисунок 1Н).

IFN-γ-продуцирующие CD137 ⁺ CD8 ⁺ Т-клетки были обнаружены у 11 из 28 (39%) ЦМВ-серонегативных и 11 из 14 (79%) ЦМВ-серопозитивных пациентов. Медианы (диапазон IQ) частоты составили 0,05% (0,01–0,12%) и 0,64% (0,22–1,90%) в общей популяции CD8 ⁺ Т-клеток для ЦМВ-серонегативных и ЦМВ-серопозитивных пациентов соответственно (рис. 1I, P < 0,01). Только 9% CD137-экспрессирующих CD8 ⁺ Т-клеток продуцировали IFNγ у ЦМВ-серонегативных пациентов по сравнению с 36% ЦМВ-серопозитивных пациентов ( P < 0.01). Статус дифференцировки этих клеток был одинаковым для обеих групп, и большинство IFNγ ⁺ CD137 ⁺ CD8 ⁺ Т-клеток были обнаружены в подмножествах EM и высокодифференцированных EMRA (рис. 1J). У ЦМВ-серонегативных пациентов 65% ЦМВ-специфических IFNγ-продуцирующих клеток коэкспрессировали CD28, в отличие от наличия 89% CD28 ^{нулевых} IFNγ-продуцирующих клеток у ЦМВ-серопозитивных пациентов ( P < 0,05; рис. 1J). Частота ЦМВ-специфических CD137 ⁺ CD8 ⁺ Т-клеток, продуцирующих ИЛ-2, была низкой, т.е.е., медиана и диапазон IQ составили: 0,001% (0,001–0,001%) и 0,024% (0,01–0,05%) от суммы CD8 ⁺ Т-клеток для ЦМВ-серонегативных и ЦМВ-серопозитивных пациентов соответственно. Поскольку менее 5% экспрессирующих CD137 Т-клеток CD8 ⁺ продуцировали IL-2, дальнейшее разделение на подмножества Т-клеток не проводилось.

CMV-специфические CD137 ⁺ CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки с наивным фенотипом, присутствующие с большей частотой у ЦМВ-серонегативных пациентов (рис. 1B, D), не продуцировали IL-2 (рис. 1H) или IFNγ (рис. 1F, J).

В совокупности эти данные показывают, что у значительной части ЦМВ-серонегативных пациентов клетки, продуцирующие цитокины, присутствуют в ЦМВ-специфических Т-клетках, экспрессирующих CD137, хотя и с меньшей частотой. Подобно CMV-серопозитивным пациентам, они в основном имеют фенотип памяти, хотя и менее дифференцированы, поскольку они более CD28 ⁺ . Никаких различий не наблюдалось при сравнении максимальной способности Т-клеток экспрессировать CD137 (рисунки S2A, B в дополнительном материале) и продуцировать цитокины между ЦМВ-серонегативными и ЦМВ-серопозитивными пациентами (рисунки S2C-E в дополнительном материале).

ЦМВ-специфическая пролиферация Т-клеток у ЦМВ-серонегативных пациентов

В дополнение к измерению способности проявлять эффекторную функцию путем продукции цитокинов, мы оценили пролиферацию Т-клеток, специфичных к ЦМВ, с использованием как лизата ЦМВ, так и пула пептидов иммунодоминантных белков pp65 и IE-1 (рис. 2А, В, типичная проточная цитометрия). пример). Индуцированная лизатом ЦМВ пролиферация наблюдалась у 10 из 12 ЦМВ-серонегативных КТ-реципиентов по CD4 ⁺ Т-клеток соответственно.Медиана (диапазон IQ) процент пролиферирующих CD4 ⁺ Т-клеток составила 2,2,55% (0,88–7,09%) (рис. 2С). Пролиферация в ответ на смесь pp65- и IE-1-перекрывающихся пептидных пулов наблюдалась у меньшей части ЦМВ-серонегативных пациентов, т.е. у 7 и 3 из 12 КТ-реципиентов для CD4 ⁺ и CD8 ⁺ T клеток [медиана и диапазон IQ: 0,35 и 0,09–0,64% (рис. 2C) и 0,33 и 0,19–1,00% (рис. 2E) соответственно]. CD4 ⁺ Т-клетки ЦМВ-серопозитивных пациентов энергично пролиферировали до ЦМВ-лизата.Средний процент пролиферирующих CD4 ⁺ Т-клеток составил 36% (рис. 2С). Пролиферация в ответ на смесь pp65- и IE-1-перекрывающихся пептидных пулов составила 6,34% (3,47–24,32%) и 9,64% (4,26–43,63%) для CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клеток соответственно. (рис. 2С, Е). У ЦМВ-серонегативных пациентов большинство (>97%) пролиферирующих CD4 ⁺ Т-клеток коэкспрессировали CD28, что свидетельствует о менее дифференцированном фенотипе. У CMV-серопозитивных пациентов примерно 10% всех пролиферирующих CD4 ⁺ Т-клеток были нулевыми CD28 (рис. 2D).Это различие в статусе дифференцировки было еще более выраженным в пролиферирующих CD8 ⁺ Т-клетках, поскольку 78% этих клеток у ЦМВ-серонегативных пациентов экспрессировали CD28 по сравнению с примерно 34% ЦМВ-серопозитивных пациентов ( P <0,05) (рис. 2F). ). Частота ЦМВ-специфических IFNγ-продуцирующих CD137 ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток и IL-2-продуцирующих CD137 ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток положительно коррелировала с процентом пролиферирующих CD4 ⁺ Т-клеток [для IFNγ] : R с = 0.63; P = 0,02 (ЦМВ-лизат) и R с = 0,71; P = 0,02 (пептиды pp65/IE-1), для IL-2: R s = 0,62; P = 0,02 (ЦМВ-лизат) и R с = 0,74; P = 0,01 (пептиды pp65/IE-1)].

Рисунок 2 . Цитомегаловирусная (ЦМВ) специфическая пролиферация Т-клеток. Показан типичный пример стратегии гейтирования для анализа пролиферации Т-клеток, специфичных для ЦМВ. Вкратце, на основе характеристик прямого/бокового движения живые клетки гейтируются и изображаются на точечной диаграмме для дальнейшего отбора живых (7AAD-негативных) CD3 ⁺ Т-клеток (A) . Затем их дополнительно разрезали на CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки (A) . CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки, наконец, нанесены на график для визуализации пролиферации (разведение CFSE) и экспрессии CD28, и типичный пример фоновой пролиферации в CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки показан на последних двух графиках. на панели A. На панели (B) типичные (выявляемые) пролиферативные ответы CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клеток на ЦМВ-лизат (только CD4 ⁺ Т-клетки; верхние графики) или смесь перекрывающиеся пептиды для pp65/IE-1 (как CD4 ⁺ , так и CD8 ⁺ Т-клетки; средний и нижний графики соответственно) изображены для ЦМВ-серонегативного (левая панель) и ЦМВ-серопозитивного пациента (правая панель).Процент CMV-специфичных пролиферирующих CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клеток, с поправкой на частоту пролиферирующих CD4 ⁺ или CD8 ⁺ Т-клеток в отсутствие стимула, изображен на панелях (C, E). соответственно. Разделение нескорректированных пролиферирующих Т-клеток, индуцированных лизатом или пептидом ЦМВ (установлено на 100%), на клетки, лишенные или экспрессирующие CD28, показаны на панелях (D, F) для CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клеток, соответственно.ЦМВ-серонегативные (с обнаруживаемым ответом) и ЦМВ-серопозитивные пациенты показаны закрытыми и незакрашенными символами соответственно, а столбцы представляют собой медианы и межквартильный размах групп пациентов. * Р < 0,05; ** Р < 0,01.

Низкая частота ЦМВ-специфических IgG ASC у ЦМВ-серонегативных пациентов

Затем мы оценили, могут ли ЦМВ-специфические В-клетки памяти быть обнаружены в кровообращении ЦМВ-серонегативных пациентов. Частота плазменных бластов в кровотоке очень низкая, но они могут быть вызваны В-клетками при поликлональной стимуляции.Общее количество В-клеток и ответы могут быть отрицательно затронуты у пациентов с терминальной почечной недостаточностью, и поэтому мы впервые задокументировали, что этот протокол действительно может индуцировать плазменные бласты. Как показано на фиг.3А, бласты плазмы индуцировались (CD27 ⁺ CD38 ^{высокая} CD19 ⁺ , от 1,4 до 48,1%) после 5-дневной поликлональной стимуляции. Затем с помощью ELISpot количественно определяли общий IgG и CMV-IgG ASC. CMV-IgG ASC были обнаружены выше фона у 4 из 11 (36%) ЦМВ-серонегативных пациентов, а чистая медиана (диапазон IQ) CMV-специфических IgG ASC составила только 1/10 ⁵ (1–10/10 ⁵ ), т.е.е., 0,08% (0,02–0,14%) от общего IgG ASC (рис. 3B, C). Все ЦМВ-серопозитивные пациенты имели обнаруживаемые CMV-IgG ASC [медиана 45 клеток/10 ⁵ (7–114/10 ⁵ ), 0,38% (0,11–1,70%) от общего IgG ASC]. Интересно, что CMV-специфические IFNγ-, а также IL-2-продуцирующие CD137 ⁺ CD4 ⁺ Т-клетки всей группы пациентов (ЦМВ-серопозитивные и ЦМВ-серонегативные пациенты) положительно коррелировали с количеством ЦМВ-специфических IgG. ASC ( R s = 0,52; P < 0.05 и R с = 0,53; P < 0,05 соответственно).

Рисунок 3 . Цитомегаловирус (ЦМВ)-специфические В-клеточные ответы. Анализ B-клеток ELISpot проводили для подсчета клеток, секретирующих антитела, секретирующие CMV-специфический и общий иммуноглобулин G (IgG) (ASC). На панели (A) приведен типичный пример проточной цитометрии бластов В-клеток, идентифицированных как клетки CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^high , перед последующей 5-дневной стимуляцией R848 и рекомбинантным IL-. 2 с левой стороны.Справа показаны индивидуальные и медианные частоты В-клеточных бластов до стимуляции и после 5-дневной стимуляции у 15 реципиентов почечного трансплантата (11 ЦМВ-серонегативных и 4 ЦМВ-серопозитивных пациента). После стимуляции В-клеток клетки переносили в различном количестве на лунку в лунки 96-луночного планшета B-ELISpot, покрытые лизатом ЦМВ или антителом против человеческого IgG или непокрытые (содержащие PBS; фоновые клетки, продуцирующие IgG). На панели (B) показаны репрезентативные примеры фоновых, CMV-специфических и общих IgG ASC, определенных у CMV-серопозитивных и CMV-серонегативных пациентов. На панели (C) индивидуальные и средние (выявляемые) CMV-специфические и общие IgG ASC, с поправкой на фон (количество пятен в отсутствие покрывающих антител) для CMV-серопозитивных (незаштрихованные символы) и CMV-серонегативных (закрытые символы) символы) изображены больные. * Р < 0,05; *** Р < 0,001.

ЦМВ-специфический CD137

ЦМВ-специфический Т-клеточный ответ у ЦМВ-серонегативных пациентов оценивали на клиническую значимость, связывая его с возникновением ЦМВ-виремии после трансплантации.У 13 из 28 (46%) ЦМВ-серонегативных пациентов в течение первого года после трансплантации ЦМВ-серопозитивной донорской почки развилась ЦМВ-виремия. ЦМВ-серонегативные пациенты с ЦМВ-специфическими CD137 ⁺ IFNγ ⁺ CD4 ⁺ Т-лимфоциты до трансплантации имели более низкий риск развития ЦМВ-виремии после трансплантации с ЦМВ-серопозитивной донорской почкой по сравнению с пациентами без (относительный риск: 0,43, P = 0,03). Не наблюдалось различий в процентном содержании ЦМВ-специфических IFNγ-продуцирующих CD137 ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток между ЦМВ-серонегативными пациентами без и с ЦМВ-виремией (данные не показаны).

ЦМВ-ассоциированные дефекты Т-клеток, имитирующие старение Т-клеток, отсутствуют у ЦМВ-серонегативных пациентов с ЦМВ-специфичными Т-клетками

Латентность цитомегаловируса оставляет четкий отпечаток пальца на Т-клеточной иммунной системе. Связанные с ЦМВ изменения в компартменте циркулирующих Т-клеток у ЦМВ-серопозитивных пациентов с ТХПН включают уменьшение длины теломер, значительное увеличение пула Т-клеток CD8 ⁺ и повышение статуса дифференцировки Т-клеток памяти, особенно индукцию CD28. ^{нулевые} Т-клетки как в CD4 ⁺ , так и в CD8 ⁺ Т-клетках (21, 22).Однако таких изменений не наблюдалось при сравнении ЦМВ-серонегативных пациентов с определяемыми ЦМВ-специфичными CD137-экспрессирующими IFNγ-продуцирующими CD4 ⁺ Т-клетками и без них (таблица 2).

Таблица 2 . Влияние ЦМВ-иммунитета на параметры Т-клеток перед трансплантацией.

Обсуждение

В этом исследовании мы оценили наличие ЦМВ-специфического клеточного и гуморального иммунитета в когорте ЦМВ-серонегативных пациентов и оценили клиническую значимость в отношении риска ЦМВ-виремии после трансплантации почки.Данные выявили наличие низкой частоты ЦМВ-специфических Т-клеток более чем у половины этих пациентов. Интересно, что, в частности, IFNγ-продуцирующие ЦМВ-специфические CD4 ⁺ Т-клетки были связаны с защитой от ЦМВ-виремии после трансплантации почки от ЦМВ-серопозитивного донора. Таким образом, защитный клеточный иммунитет против ЦМВ может существовать в отсутствие сывороточных анти-ЦМВ IgG.

Нередко наличие клеточного иммунитета при отсутствии защитных антител.Возможные объяснения этой диссоциации могут заключаться в том, что либо клеточный иммунитет неэффективен для индукции адекватного гуморального иммунитета (6, 7), либо недостаточно поддерживаются защитные антитела. Оба эти механизма могут быть справедливы для пациентов с терминальной почечной недостаточностью. Известно, что зависимые от Т-клеток вакцины (например, HBsAg, столбнячный анатоксин и дифтерийная вакцина) плохо индуцируют защитные титры антител у этих пациентов, и титры антител плохо поддерживаются (23–25). Детальный анализ динамики и качества антигенспецифического Т-клеточного ответа после вакцинации HBsAg у пациентов с ХПН показал плохую генерацию Т-клеток памяти CD4 ⁺ (6, 7).В частности, присутствие антиген-специфических Т-клеток CD4 ⁺ EM значительно коррелировало с титрами анти-HBsAg, и аналогичная связь может быть показана для анти-ЦМВ IgG. Результаты этого исследования также показали статистически значимую связь между наличием IL-2 или IFNγ-продуцирующих CMV-специфических CD4 ⁺ T-клеток и анти-CMV IgG ASC. Таким образом, слабая индукция ЦМВ-специфического Т-клеточного ответа может лежать в основе неадекватной генерации анти-ЦМВ гуморального ответа. Кроме того, все еще возможно, что слабый, но обнаруживаемый анти-ЦМВ гуморальный ответ был изначально генерирован, но не поддерживался должным образом.

Хотя могут возникнуть проблемы, связанные с надежным измерением низких частот ЦМВ-специфических Т-клеток, многопараметрический проточный цитометрический анализ CD137, как описано ранее (17), позволяет получить подробную характеристику общего пула антиген-специфических Т-клеток, который связан с другими параметрами, проанализированными в этой статье, и связан с клиническим исходом, т.е.д., ЦМВ-виремия. Детальный анализ ЦМВ-специфического ответа в субпопуляциях Т-клеток показал, что ЦМВ-специфические Т-клетки памяти CD4 ⁺ и CD8 ⁺ были менее дифференцированы у ЦМВ-серонегативных пациентов, чем у ЦМВ-позитивных пациентов. Это было очевидно по относительно большему количеству CD28 ⁺ Т-клеток памяти и меньшему количеству ЦМВ-специфических Т-клеток, продуцирующих эффекторные цитокины, такие как IFNγ и IL-2. Интерес представляет обнаружение CMV-специфического ответа CD137 ⁺ в фенотипически наивных Т-клетках, не продуцирующих цитокины.Эти клетки могут быть частью так называемых ранних разветвленных Т-клеток памяти, которые фенотипически являются наивными Т-клетками, но на самом деле являются Т-клетками памяти на ранней стадии развития, некоторые из которых способны выполнять эффекторные функции (26). Опять же, это открытие поддерживает концепцию менее дифференцированного Т-клеточного ответа, специфичного для ЦМВ. В этом отношении статья Redeker et al. (27) хорошо проиллюстрировали на мышиной модели, что большие межиндивидуальные различия в высоте CMV-специфического ответа Т-клеток зависят от исходной вирусной нагрузки, которая также влияет на степень раздувания Т-клеток памяти и фенотип ЦМВ-специфические Т-клетки.ЦМВ-инфекция обычно приводит к длительным существенным изменениям в циркулирующих Т-клетках, особенно у пациентов с тХПН (13, 28–31). В частности, высокодифференцированные Т-клетки EMRA, лишенные Т-клеток CD28, размножаются в популяции Т-клеток CD8 ⁺ и в меньшей степени в популяции Т-клеток CD4 ⁺ (13–15). Этот типичный след ЦМВ-инфекции в составе циркулирующих Т-клеток не был обнаружен в ЦМВ-специфических Т-клетках ЦМВ-серонегативных пациентов. Это указывает на то, что эти пациенты столкнулись с ЦМВ, но получили лишь ограниченный Т-клеточный ответ.Наиболее вероятным объяснением является низкий уровень воздействия вирусных антигенов, который может не приводить к специфическому отпечатку, индуцированному высоким воздействием вирусного антигена, что приводит к устойчивым титрам ЦМВ-специфических IgG в сыворотке (32, 33). Кроме того, часть ЦМВ-серопозитивных пациентов не имела или имела низкую частоту ЦМВ-специфических CD8 ⁺ Т-клеток, но имела ЦМВ-специфические CD4 ⁺ Т-клетки, а также ЦМВ-IgG-продуцирующие клетки перед трансплантацией, которые были достаточно для предотвращения реактивации ЦМВ.Это контрастировало с работой Tey et al. в котором описаны реципиенты трансплантата гемопоэтических стволовых клеток, другая группа пациентов с ослабленным иммунитетом, дефицит восстановления специфического иммунитета к ЦМВ с более высокой вирусной нагрузкой (34). Наши данные удивительно согласуются с недавним исследованием Lucia et al. (11), которые идентифицировали ЦМВ-специфические Т-клеточные ответы у 30% ЦМВ-серонегативных лиц. Однако их данные были получены с помощью ELISpot, и поэтому в них отсутствует более глубокий анализ вовлеченных подмножеств Т-клеток.Они также заявляют об обнаружении CMV-специфических В-клеток памяти, но, к сожалению, о частотах не сообщалось.

В заключение, оценка анти-ЦМВ-IgG, по-видимому, недостаточна для правильной идентификации ЦМВ-наивных индивидуумов, так как значительная часть имеет слабый клеточный ЦМВ-специфический ответ, который связан с защитой от ЦМВ-виремии после трансплантации ЦМВ. — серопозитивная донорская почка. Поэтому мы предлагаем включить оценку клеточного иммунитета в оценку риска перед трансплантацией почки.Кроме того, мониторинг ЦМВ-специфического клеточного иммунитета после трансплантации, то есть в конце анти-ЦМВ профилактики, может быть полезен для дальнейшего выявления пациентов с риском ЦМВ-виремии, которым требуется дополнительная противовирусная терапия или коррекция иммунодепрессантов (35).

Заявление об этике

Все пациенты дали письменное информированное согласие на участие в этом исследовании. Исследование было одобрено Комитетом по медицинской этике Erasmus MC (номер METC 2010-080) и проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией и Стамбульской декларацией.

Вклад авторов

NL разработала эксперименты, провела и проанализировала данные и написала рукопись; LH, BD и RM провели эксперименты и проанализировали данные; JK интерпретировал данные и отредактировал рукопись; и МБ разработали эксперименты и отредактировали рукопись.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Финансирование

Это исследование проводилось при финансовой поддержке Голландского почечного фонда (KSPB.10.12) и Китайского стипендиального совета, финансирующего стипендию доктора философии LH (номер файла: 201307720043).

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2017.01137/full#supplementary-material.

Рисунок S1 . Типичная стратегия гейтирования для специфичных для цитомегаловируса (ЦМВ) CD137-экспрессирующих и цитокин-продуцирующих CD4 ⁺ Т-клеток.Типичный пример проточной цитометрии изображен для анализа CMV-специфических экспрессирующих CD137 и продуцирующих цитокины CD4 ⁺ Т-клеток для CMV-серопозитивных (A–C) и CMV-серонегативных (D–F) пациент. Вкратце, на основе характеристик прямого/бокового движения живые клетки гейтируют и изображают на точечной диаграмме для дальнейшего отбора Т-клеток CD4 ⁺ и CD8 ⁺ . CMV-специфические CD137-экспрессирующие CD4 ⁺ Т-клетки отбирают [ (A,D) , первый график], а также клетки IFNγ и IL-2 в CD137-экспрессирующих CD4 ⁺ Т-клетках [ ( A,D) , второй участок]. CD137-экспрессирующие CD4 ⁺ Т-клетки впоследствии разделяют на наивные и разные подмножества Т-клеток памяти [ (A,D) , третий график] с использованием экспрессии CCR7 и CD45RO [CCR7 ⁺ CD45RO ^— : наивные, CCR7 ⁺ CD45RO ⁺ : Центральная память (см), CCR7 ^— CD45RO ⁺ : эффекторная память (EM) и CCR7 ^— CD45RO ^— : EMRA] или CD28 ⁺ и CD28 ^NULL Т-клетки [ (A,D) , четвертый график].IFNγ (B,E) и IL-2 (C,F) -продуцирующие CD137-экспрессирующие CD4 ⁺ Т-клетки анализировали аналогичным образом. Кроме того, тот же подход был также применен для анализа CMV-специфических экспрессирующих CD137 и продуцирующих цитокины Т-клеток CD8 ⁺ (не показано). Процент CD137-экспрессирующих CD4 ⁺ Т-клеток от общего количества CD4 ⁺ Т-клеток и процент цитокинов ⁺ в CD137 ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток представлен как доля CD137 ⁺

CD 137 ⁺ + Т-клеток (установлено на 100%), а в скобках указана частота CD137 ⁺ цитокина ⁺ в общем количестве CD4 ⁺ Т-клеток. Вскрытие в отношении определенного фенотипа Т-клеток проводят путем установления % CD137 ⁺ или CD137 ⁺ цитокинов ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток за 100%.

Рисунок S2 . CD137-экспрессирующие и цитокин-продуцирующие Т-клетки при стимуляции ацетатом форболмиристата (ФМА) и иономицином. Периферические мононуклеарные клетки пациентов стимулировали в течение 12 часов в присутствии брефельдина А и αCD49d по отдельности или в смеси ФМА и иономицина. Затем клетки окрашивают клеточной поверхностью и внутриклеточно, чтобы определить максимальную способность Т-клеток экспрессировать CD137 и продуцировать цитокины.ФМА/иономицин-индуцированные CD137-экспрессирующие CD4 ⁺ (A) и CD8 ⁺ (B) Т-клетки, с поправкой на фон (только αCD49d), представлены в процентах от общего количества CD4 ⁺ или CD8 ⁺ Т-клетки. Аналогичный подход применяется для индуцированных ФМА/иономицином CD137-экспрессирующих IFN-γ- и IL-2-продуцирующих CD4 ⁺ (C, E) и CD137-экспрессирующих IFN-γ CD8 ⁺ Т-клеток (D ) . Закрытые и незакрашенные символы/столбики представляют цитомегаловирусных (ЦМВ)-серонегативных и ЦМВ-серопозитивных пациентов, соответственно.

Каталожные номера

1. Fiala M, Payne JE, Berne TV, Moore TC, Henle W, Montgomerie JZ, et al. Эпидемиология цитомегаловирусной инфекции после трансплантации и иммуносупрессии. J Infect Dis (1975) 132(4):421–33. doi: 10.1093/infdis/132.4.421

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

2. Harvala H, Stewart C, Muller K, Burns S, Marson L, MacGilchrist A, et al. Высокий риск цитомегаловирусной инфекции после трансплантации паренхиматозных органов, несмотря на профилактическую терапию. J Med Virol (2013) 85(5):893–8. дои: 10.1002/jmv.23539

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

3. Jonjic S, Mutter W, Weiland F, Reddehase MJ, Koszinowski UH. Персистирующая цитомегаловирусная инфекция с ограниченным сайтом после селективного длительного истощения CD4+ Т-лимфоцитов. J Exp Med (1989) 169(4):1199–212. дои: 10.1084/jem.169.4.1199

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

4. Каламс С.А., Уокер Б.Д.Критическая потребность в помощи CD4 в поддержании эффективного ответа цитотоксических Т-лимфоцитов. J Exp Med (1998) 188(12):2199–204. дои: 10.1084/jem.188.12.2199

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

5. Малой К.Дж., Буркхарт С., Фрир Г., Рулике Т., Пирчер Х., Коно Д.Х. и соавт. Качественные и количественные требования к противовирусной защите, опосредованной CD4+ Т-клетками. J Immunol (1999) 162(5):2867–74.

Реферат PubMed | Академия Google

6.Литьенс Н.Х., Хьюсман М., Хидждра Д., Ламбрехт Б.М., Ститтелар К.Дж., Бетжес М.Г. ИЛ-2, продуцирующие CD4+ Т-лимфоциты памяти, тесно связаны с образованием IgG-секретирующих плазматических клеток. J Immunol (2008) 181(5):3665–73. doi:10.4049/jиммунол.181.5.3665

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

7. Litjens NH, Huisman M, van den Dorpel M, Betjes MG. Нарушение иммунного ответа и антиген-специфической памяти CD4+ Т-клеток у гемодиализных больных. J Am Soc Nephrol (2008) 19(8):1483–90.дои: 10.1681/ASN.20070

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

8. Кумар Д., Черненко С., Мусса Г., Кобос И., Мануэль О., Прейксайтис Дж. и соавт. Клеточный иммунитет для прогнозирования цитомегаловирусной болезни у реципиентов паренхиматозных органов высокого риска. Am J Transplant (2009) 9(5):1214–22. doi:10.1111/j.1600-6143.2009.02618.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

9. Мануэль О., Хусейн С., Кумар Д., Зайас С., Маухортер С., Леви М.Е. и соавт.Оценка цитомегаловирус-специфического клеточного иммунитета для прогнозирования цитомегаловирусной болезни у реципиентов паренхиматозных органов высокого риска: многоцентровое когортное исследование. Clin Infect Dis (2013) 56(6):817–24. doi: 10.1093/cid/cis993

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

10. Sester M, Gartner BC, Sester U, Girndt M, Mueller-Lantzsch N, Kohler H. Всегда ли точен серологический статус цитомегаловируса? Сравнительный анализ гуморального и клеточного иммунитета. Трансплантация (2003) 76(8):1229–30. дои: 10.1097/01.TP.0000083894.61333.56

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

11. Lucia M, Crespo E, Melilli E, Cruzado JM, Luque S, Llaudo I, et al. Предварительно сформированные частоты Т- и В-клеток памяти, специфичных для цитомегаловируса (ЦМВ), выявляют защищенных ЦМВ-сенсибилизированных лиц среди серонегативных реципиентов почечного трансплантата. Clin Infect Dis (2014) 59(11):1537–45. doi:10.1093/cid/ciu589

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

12.Саллусто Ф., Лангенкамп А., Гегинат Дж., Ланзавеккья А. Функциональные подмножества Т-клеток памяти, идентифицированные по экспрессии CCR7. Curr Top Microbiol Immunol (2000) 251:167–71.

Академия Google

14. Litjens NH, de Wit EA, Betjes MG. Дифференциальное влияние возраста, цитомегаловирусной серопозитивности и терминальной стадии почечной недостаточности (ESRD) на циркулирующие субпопуляции Т-лимфоцитов. Immun Aging (2011) 8(1):2. дои: 10.1186/1742-4933-8-2

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

15.Meijers RW, Litjens NH, de Wit EA, Langerak AW, van der Spek A, Baan CC, et al. Цитомегаловирус частично способствует преждевременному иммунологическому старению Т-клеточного компартмента, связанному с уремией. Clin Exp Immunol (2013) 174(3):424–32. doi:10.1111/cei.12188

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

16. Litjens NH, Huisman M, Baan CC, van Druningen CJ, Betjes MG. CD4(+) Т-клетки, специфичные для вакцины против гепатита В, могут быть обнаружены и охарактеризованы на уровне отдельных клеток: ограниченная полезность дендритных клеток в качестве усилителей сигнала. J Immunol Methods (2008) 330(1–2):1–11. doi:10.1016/j.jim.2007.10.013

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

17. Litjens NH, de Wit EA, Baan CC, Betjes MG. Индуцированный активацией CD137 представляет собой быстрый анализ для идентификации и многопараметрического проточного цитометрического анализа аллореактивных Т-клеток. Clin Exp Immunol (2013) 174(1):179–191. doi:10.1111/cei.12152

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

18. Bouvy AP, Kho MM, Klepper M, Litjens NH, Betjes MG, Weimar W, et al.Кинетика гомеостатической пролиферации и тимопоэза после индукционной терапии рАТГ у пациентов с трансплантацией почки. Трансплантация (2013) 96(10):904–13. дои: 10.1097/TP.0b013e3182a203e4

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

19. Betjes MG, Langerak AW, van der Spek A, de Wit EA, Litjens NH. Преждевременное старение циркулирующих Т-клеток у пациентов с терминальной стадией почечной недостаточности. Kidney Int (2011) 80(2):208–17. doi:10.1038/ki.2011.110

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

20.Baerlocher GM, Vulto I, de Jong G, Lansdorp PM. Проточная цитометрия и FISH для измерения средней длины теломер (flow FISH). Nat Protoc (2006) 1(5):2365–76. doi:10.1038/nprot.2006.263

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

21. Дерхованесян Э., Ларби А., Павелец Г. Биомаркеры иммуностарения человека: влияние цитомегаловирусной инфекции. Curr Opin Immunol (2009) 21(4):440–5. doi:10.1016/j.coi.2009.05.012

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

22.Викби А., Йоханссон Б., Олссон Дж., Лофгрен С., Нильссон Б.О., Фергюсон Ф. Расширение субпопуляций CD8 Т-лимфоцитов периферической крови и связь с серопозитивностью к цитомегаловирусу у пожилых людей: шведское иммунное исследование NONA. Exp Gerontol (2002) 37 (2–3): 445–53. дои: 10.1016/S0531-5565(01)00212-1

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

23. Crosnier J, Jungers P, Courouce AM, Laplanche A, Benhamou E, Degos F, et al. Рандомизированное плацебо-контролируемое исследование вакцины против поверхностного антигена гепатита В во французских отделениях гемодиализа: I, Медицинский персонал. Ланцет (1981) 1(8218):455–9.

Академия Google

24. Stevens CE, Alter HJ, Taylor PE, Zang EA, Harley EJ, Szmuness W. Вакцина против гепатита B у пациентов, получающих гемодиализ. Иммуногенность и эффективность. N Engl J Med (1984) 311(8):496–501. дои: 10.1056/NEJM198408233110803

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

25. Гирндт М., Питч М., Колер Х. Иммунизация против столбняка и ее связь с вакцинацией против гепатита В у пациентов с хронической почечной недостаточностью. Am J Kidney Dis (1995) 26(3):454–60.

Реферат PubMed | Академия Google

26. Song K, Rabin RL, Hill BJ, De Rosa SC, Perfetto SP, Zhang HH, et al. Характеристика субпопуляций CD4+ Т-клеток памяти выявляет ранние разветвленные пути дифференцировки Т-клеток у человека. Proc Natl Acad Sci U S A (2005) 102(22):7916–21. doi:10.1073/pnas.0409720102

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

28. Meijers RW, Litjens NH, Hesselink DA, Langerak AW, Baan CC, Betjes MG.Первичная цитомегаловирусная инфекция значительно влияет на циркулирующие Т-клетки у реципиентов почечного трансплантата. Am J Transplant (2015) 15 (12): 3143–56. doi:10.1111/ajt.13396

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

29. Гамадия Л.Е., Рентенаар Р.Дж., Баарс П.А., Реммерсвал Э.Б., Сурачно С., Вел Дж.Ф. и соавт. Дифференцировка цитомегаловирус-специфических CD8(+) Т-клеток у здоровых и иммуносупрессивных носителей вируса. Кровь (2001) 98(3):754–61. дои: 10.1182/кровь.В98.3.754

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

30. ван Леувен Э.М., Реммерсваль Э.Б., Хемскерк М.Х., тен Берге И.Дж., ван Лиер Р.А. Сильная селекция вирусспецифических цитотоксических CD4+ Т-клеточных клонов при первичной цитомегаловирусной инфекции человека. Кровь (2006) 108(9):3121–7. дои: 10.1182/кровь-2006-03-006809

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

31. Ван Леувен Э.М., Реммерсваль Э.Б., Фоссен М.Т., Рошани А.Т., Вертхайм-ван Диллен П.М., Ван Лиер Р.А. и соавт.Появление CD4+CD28-гранзима B+, специфичной для цитомегаловируса субпопуляции Т-клеток после выздоровления от первичной цитомегаловирусной инфекции. J Immunol (2004) 173(3):1834–41. doi:10.4049/jиммунол.173.3.1834

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

32. Utzschneider DT, Alfei F, Roelli P, Barras D, Chennupati V, Darbre S, et al. Высокие уровни антигена индуцируют истощенный фенотип при хронической инфекции, не нарушая экспансии и выживания Т-клеток. J Exp Med (2016) 213(9):1819–34. doi:10.1084/jem.20150598

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

33. Mayer BT, Krantz EM, Swan D, Ferrenberg J, Simmons K, Selke S, et al. Транзиторные оральные цитомегаловирусные инфекции человека указывают на неэффективное распространение вируса из очень небольшого числа первоначально инфицированных клеток. J Virol (2017) 91(12):e00380–17. doi:10.1128/ОВИ.00380-17

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

34. Tey SK, Kennedy GA, Cromer D, Davenport MP, Walker S, Jones LI, et al.Клиническая оценка противовирусного CD8+ Т-клеточного иммунного мониторинга с использованием анализа QuantiFERON-CMV(R) для выявления пациентов с аллогенной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток высокого риска с осложнениями ЦМВ-инфекции. PLoS One (2013) 8(10):e74744. doi:10.1371/journal.pone.0074744

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

35. Barabas S, Spindler T, Kiener R, Tonar C, Lugner T, Batzilla J, et al.