Кариотип и методы его исследования – 58. Цитогенетические методы изучения наследственности человека, возможности методов. Пренатальная диагностика.

1. Понятие о кариотипе и кариограмме.

Кариотип — это совокупность всех хромосом диплоидного набора клетки, который характеризуется количеством хромосом и особенностями строения каждой хромосомы. Для нормального кариотипа характерно следующее:

• 
  присутствует нормальное количество хромосом,
  
• 
  все хромосомы представлены парами гомологичных друг другу хромосом,
  
• 
  каждая хромосома имеет нормальное строение: характерное для нее расположение центромеры, соотношение и строение плеч, отсутствуют хромосомные мутации.
  

Организмы разных видов различаются по кариотипу: по числу и/или индивидуальным особенностям тех или иных хромосом. Кариотип и хромосомы человека обладают многими признаками, общими для кариотипа и хромосом организмов других видов.

1. 
   Хромосомы состоят из хроматина – комплекса ДНК с многочисленными белками.
   
2. 
   Структурной единицей хроматина является нуклеосома – комплекс из четырех пар гистоновых белков, вокруг которого намотано около двух витков молекулы ДНК. В одной хромосоме находится только одна молекула ДНК, которая намотана на тысячи гистоновых комплексов.
   
3. 
   Разные участки хроматина различаются по степени конденсации, или упаковки в пространстве. Эухроматин слабо конденсирован и содержит активно функционирующие гены. Гетерохроматин сильно конденсирован и содержит нефункционирующие гены и участки ДНК, не содержащие гены. Участки гетерохроматина окрашиваются красителями сильнее, чем участки эухроматина и в микроскоп выглядят более темными.
   
4. 
   При делении клетки хроматин, конденсируясь, приобретает вид плотных палочковидных структур, особенно хорошо видимых в метафазу митоза.
   
5. 
   Диплоидный набор хромосом представляет собой набор пар гомологичных друг другу хромосом. Хромосомы каждой пары гомологичны друг другу и негомологичны всем остальным хромосомам. Кариотип человека включает в себя 46 хромосом: 22 пары аутосом и две половые хромосомы: две Х-хромосомы у женщин, Х- и Y-хромосомы у мужчин.
   
6. 
   Негомологичные хромосомы различаются по длине и форме, имеют приблизительно одинаковую толщину.
   
7. 
   Все хромосомы имеют два плеча и расположенный между ними истонченный участок – центромеру, или первичную перетяжку. В области первичной перетяжки расположен кинетохор – плоская структура, белки которой, взаимодействуя с микротрубочками веретена деления, обеспечивают перемещения хромосом во время деления клетки.
   
8. 
   Некоторые хромосомы имеют вторичную перетяжку, в области которой расположены гены рибосомных РНК, происходит синтез рРНК и образуется ядрышко ядра. У человека вторичную перетяжку имеют хромосомы 13, 14, 15, 21 и 22.
   
9. 
   В кариотипе находятся хромосомы трех типов, различающиеся по расположению центромеры и,соответственно, соотношению плеч.
   
10. 
    Концы каждой хромосомы – это теломеры. У человека ДНК теломерного участка представляет собой многократно повторяющуюся нуклеотидную последовательность 5′ ТТАГГГ 3′ в одной из нуклеотидных цепей ДНК.
    
11. 
    После каждого акта репликации и деления клетки происходит укорочение теломерных участков хромосом.
    
12. 
    В диплоидном наборе женских особей находится две Х-хромосомы, а в диплоидном наборе мужских особей – одна Х-хромосома и одна Y-хромосома. Х- и Y-хромосомы различаются по длине, форме и наборам генов. У человека ген SRY Y-хромосомы обусловливает развитие мужского пола.
    
13. 
    Во время профазы и метафазы митоза каждая хромосома состоит из двух одинаковых хроматид – одинаковых копий материнской хромосомы, образовавшихся после репликации ДНК.
    

^

Для изучения кариотипа обычно используют лейкоциты периферической крови, клетки красного костного мозга и некоторые другие клетки. При необходимости изучают клетки оболочек зародыша и плода, так как они имеют такой же кариотип и генотип, как клетки еще неродившегося организма, поскольку тоже являются потомками зиготы.

Клетки помешают в питательную среду и побуждают их к делению с помощью специальных стимуляторов деления. Одним из стимуляторов деления является вещество растительного происхождения фитогемагглютинин (ФГА). Фитогемагглютинин является углеводом обыкновенной фасоли Phaseolus vulgaris, способный агглютинировать эритроциты. Фитогемагглютинин является сильным митогеном – веществом, стимулирующим деление клеток путем митоза.

Под влиянием ФГА клетки начинает делиться путем митоза. Затем в культуральную среду с делящимися клетками добавляют колхицин. Это алкалоид растительного происхождения, обычно получаемый из безвременника (зимовника) осеннего (Colchicum autumnale) или других представителей семейства лилейные. Колхицин препятствует образованию микротрубочек из белка тубулина. В делящейся клетке микротрубочки входят в состав веретена деления и в норме сначала обеспечивают передвижение всех хромосом в область экватора веретена деления, а затем участвуют в расхождении хроматид каждой хромосомы в разные стороны, к разным полюсам веретена деления клетки. Поэтому в присутствии колхицина деление всех клеток останавливается на одной и той же стадии митоза: в конце профазы, непосредственно перед метафазой. В зарубежной научной литературе эта стадия называется прометафазой. В эту стадию все хромосомы полностью конденсированы и хорошо видны в световой микроскоп в виде палочковидных структур, расположенных в одной плоскости. Совокупность всех таких хромосом одной клетки называется метафазной пластинкой (рис.1).

Для удобства изучения живые клетки помещают в гипотонический раствор поваренной соли. В таком растворе вода заходит в клетку, клетка увеличивается в размере, и хромосомы более свободно распределяются в цитоплазме — на большем, чем прежде, расстоянии друг от друга.

Затем хромосомы окрашивают, фотографируют и изучают их изображение под микроскопом. Окраску проводят простыми, диффенциальными или флюоресцентными красителями, которые помогают идентифицировать хромосомы.

Рис.1. Метафазная пластинка человека.

1 – большая метацентрическая хромосома

2 – маленькая акроцентрическая хромосома

3 – большая субметацентрическая хромосома

4 – маленькая метацентрическая хромосома

5 – средняя акроцентрическая хромосома.

Как видно из рис.1, хромосомы различаются по размеру и форме. Все они имеют Х- или Y-образную форму, что обусловлено тем, что дочерние хроматиды – копии материнской хромосомы — остаются соединенными в области первичной перетяжки.

В метафазной пластинке каждая хромосома состоит из двух одинаковых хроматид. Для каждой хромосомы диплоидного набора имеется лишь одна, парная ей хромосома. Парные хромосомы называются гомологичными друг другу хромосомами. Гомологичные хромосомы имеют одинаковые внешние признаки: длину; форму (расположение первичной перетяжки и соответствие плеч, наличие или отсутствие вторичной перетяжки) и одинаковую степень конденсации хроматина в тех или иных участках: участки с сильно конденсированным хроматином выглядят темными, а участки со слабо конденсированным хроматином — более светлыми. По этим же признакам негомологичные друг другу хромосомы отличаются друг от друга. Различают следующие типы хромосом человека (рис.2):

• 
  Метацентрические, равноплечие хромосомы: первичная перетяжка (центромера) расположена в центре (посередине) хромосомы, плечи хромосомы одинаковые.
  
• 
  Субметацентрические, почти равноплечие хромосомы: центромера находится недалеко от середины хромосомы, плечи хромосомы незначительно отличаются по длине.
  
• 
  Акроцентрические, очень неравноплечие хромосомы: центромера находится очень далеко от центра (середины) хромосомы, плечи хромосомы существенно различаются по длине.
  

Рис.2. Типы хромосом человека.

Поскольку каждая пара гомологичных друг другу хромосом имеет характерные для них признаки, то это позволяет идентифицировать конкретные хромосомы. Идентифицировав хромосомы, строят кариограмму: располагают хромосомы в порядке уменьшения размера, раскладывая их по группам в зависимости от размера и формы. При построении кариограммы половые хромосомы располагают отдельно от аутосом, хотя Х-хромосома относится к хромосомам группы С, а Y-хромосома – к хромосомам группы G.

Кариограмму строят при изучении кариотипа конкретного человека. Обобщенная, идеализированная кариограмма, в которой представлены особенности кариотипа вида, называется идиограммой. Идентифицируя хромосомы и строя кариограмму конкретного человека, врач-генетик всегда имеет перед собой образец — идиограмму вида Человек разумный.

На рис. 3 представлена кариограмма мужчины с нормальным кариотипом. В прямоугольной рамке показаны половые хромосомы женщины с нормальным кариотипом.

Рис. 3.

Рис. 3. Нормальная кариограмма человека.

В первых семи рядах кариограммы представлены аутосомы групп A – G. Они одинаковы в кариотипах мужского и женского организмов. В последнем ряду представлены половые хромосомы. В мужском кариотипе это Х-хромосома группы С и Y-хромосома группы G. В женском кариотипе это две Х-хромосомы. Таким образом, кариограммы мужского и женского организмов легко отличить друг от друга: кариограмма женского организма содержит две одинаковые метацентрические хромосомы среднего размера – Х-хромосомы, а кариограмма мужского организма содержит две разные по размеру и форме хромосомы: одну метацентрическую хромосому среднего размера – Х-хромосому и одну акроцентрическую хромосому небольшого размера – Y-хромосому.

Процедура составления кариограммы вручную трудоемка и требует определенной последовательности действий. Составление кариограммы является частью лабораторной работы, которую выполняют студенты первого курса медицинского университета.

В последние годы для идентификации хромосом и построения кариограммы используют компьютерные программы. При этом изображение метафазной пластинки поступает в компьютер через видеокамеру, соединенную с люминесцентным микроскопом.

^

На лабораторной работе каждый студент получает конверт с набором из 45-47 изображений хромосом человека и лист бумаги с названиями групп хромосом. Задачей студента является правильное разложение хромосом по группам.

Работу по составлению кариограммы рекомендуют проводить в следующей последовательности:

1. 
   Все хромосомы в зависимости от формы разделите на две большие группы:
   
   • 
     акроцентрические хромосомы
     
   • 
     метацентрические и субметацентрические хромосомы
     
2. 
   Обратите внимание на акроцентрические хромосомы. Все акроцентрические хромосомы в зависимости от размера разделите на две небольшие группы:
   
   • 
     средние акроцентрические хромосомы.
     
   • 
     маленькие акроцентрические хромосомы
     
3. 
   Маленькие акроцентрические хромосомы – это хромосомы группы G. В нормальном кариотипе их может быть 4-5 хромосом в зависимости от пола человека. В нормальном женском кариотипе это 2 пары аутосом, в нормальном мужском кариотипе – 2 пары аутосом и одна Y-хромосома. У людей с с. Дауна и с. лишней Y-хромосомы группа G может содержать 5-6 хромосом. К сожалению, обычное окрашивание хромосом не позволяет с уверенностью различить хромосому 21-й пары и Y-хромосому. По этой причине набор изображений 5-и хромосом группы G может принадлежать и женщине с с. Дауна, и мужчине с с. Клайнфельтера, а набор изображений 6-и хромосом группы G может принадлежать и мужчине с с.Дауна, и мужчине с дополнительной Y-хромосомой в кариотипе. Если у вас всего 2 пары хромосом этой группы, то положите их изображения на лист с названиями групп хромосом напротив названия группы G. Если у вас имеется еще две хромосомы этой группы, то одну из них положите рядом с хромосомами 21-й пары, а другую – на место половых хромосом, считая ее Y-хромосомой. Если у вас имеется 5 хромосом этой группы, то до окончания составления кариограммы вы можете считать ее хромосомой 21-й пары или Y-хромосомой. В зависимости от вашего предварительного выбора положите 5-ю хромосому этой группы в соответствующее место листа с названиями групп хромосом.
   
4. 
   Средние акроцентрические хромосомы – это хромосомы группы D. В нормальном кариотипе их 3 пары. При с. Патау в кариотипе человека обнаруживается 7 хромосом этой группы за счет дополнительной хромосомы 13-й пары. Положите изображения хромосом группы D на лист с названиями групп хромосом в соответствующее место.
   
5. 
   Вы разложили все акроцентрические хромосомы. Теперь обратите внимание на оставшиеся не разложенными метацентрические и субметацентрические хромосомы. Все эти хромосомы в зависимости от размера разделите на две небольшие группы:
   
   • 
     крупные и средние хромосомы
     
   • 
     короткие и маленькие хромосомы.
     
6. 
   Обратите внимание на короткие и маленькие хромосомы последней группы. Выберите из них 2 пары самых маленьких метацентрических хромосом. Это хромосомы группы F. Положите изображения хромосом этой группы на лист с названиями групп хромосом в соответствующее место. Оставшиеся хромосомы – это хромосомы группы Е. В нормальном кариотипе их 3 пары. При с. Эдвардса в кариотипе человека обнаруживается 7 хромосом этой группы за счет дополнительной хромосомы 18-й пары. Положите изображения хромосом этой группы на лист с названиями групп хромосом в соответствующее место.
   
7. 
   Обратите внимание на оставшиеся не разложенными крупные и средние хромосомы. Выберите из них 3 пары самых крупных хромосом. Это метацентрические хромосомы группы А. Положите их изображения на лист с названиями групп хромосом.
   
8. 
   Из оставшихся хромосом выберите 2 пары самых больших хромосом. Это метацентрические хромосомы группы В. Положите их изображения на лист с названиями групп хромосом в соответствующее место.
   
9. 
   Все оставшиеся хромосомы – это субметацентрические хромосомы группы С. 7 пар хромосом этой группы – это аутосомы. Положите их изображения на лист с названиями групп хромосом напротив названия группы С. Все остальные хромосомы этой группы – это Х-хромосомы. Количество Х-хромосом в кариотипе конкретного человека может быть 1-3. Положите изображения Х-хромосом на лист с названиями групп хромосом в соответствующее место.
   
10. 
    Внимательно изучите составленную вами кариограмму. Кариограмма не должна содержать одновременно две крупные аномалии, поскольку это не встречается в реальной жизни. Это может случиться в том случае, если вы неправильно идентифицировали Y-хромосому, приняв ее за хромосому 21-й пары. Например, кариограмма не может содержать одновременно трисомию про 21-й хромосоме и моносомию по Х-хромосоме, то есть, кариограмма не может принадлежать человеку, страдающему одновременно с. Дауна и с.Шерешевского-Тернера. Скорее всего, в вашем распоряжении нормальная кариограмма мужчины. Для исправления ошибки достаточно перенести одну из 3-х хромосом 21-й пары на место расположения половых хромосом, поместив ее рядом с Х-хромосомой. При составлении кариограммы конкретного человека такая ситуация не возникает, так как еще до начала составления кариограммы известен пол человека и предварительный диагноз.
    

^

При анализе кариограммы от студента требуется следующее:

• 
  уметь идентифицировать пол человека
  
• 
  уметь идентифицировать нормальный кариотип человека
  
• 
  уметь идентифицировать наличие хромосомного заболевания, связанного с аномалией числа хромосом (с. Дауна, с. Клайнфельтера, с. Шерешевского-Тернера, с. Трисомии — Х, с. Патау, с. Эдвардса, с. лишней Y-хромосомы).
  

• 
  общее количество хромосом;
  
• 
  парность или непарность тех или иных хромосом;
  
• 
  количество и вид половых хромосом;
  
• 
  наличие тех или иных аномалий числа хромосом.
  

• 
  Пронумеруйте пары гомологичных хромосом; нумеруйте их даже в том случае, если гомологичные хромосомы представлены не двумя, а одной или тремя хромосомами.
  
• 
  Найдите на кариограмме аутосомы и половые хромосомы. Половые хромосомы обычно располагают отдельно от аутосом. Нормальная кариограмма содержит 22 пары аутосом и 1 пару половых хромосом. Кариограмма больного человека может содержать 45- 46 аутосом и 1-3 половых хромосомы.
  
• 
  Определите пол человека по его кариограмме. Для этого внимательно изучите половые хромосомы.
  
• 
  Если все они одинаковые, среднего размера и метацентрические, значит все они – Х-хромосомы, а перед вами кариограмма женского организма.
  
• 
  Если среди половых хромосом есть небольшая акроцентрическая хромосома, значит это – Y-хромосома, а перед вами кариограмма мужского организма.
  
• 
  Посмотрите, все ли хромосомы представлены парами.
  
• 
  Если кариограмма содержит 23 пары хромосом, значит перед вами нормальная кариограмма человека.
  
• 
  Если в кариограмме те или иные хромосомы представлены 1 или 3 хромосомами, значит перед вами кариограмма с геномной мутацией – отсутствием или избытком хромосом. В этом случае кариограмма содержит 45 или 47 хромосом.
  
• 
  Определите порядковый номер пары хромосом, в которой обнаружена геномная мутация. Наиболее часто встречаются следующие аномалии:
  
• 
  аномалии числа аутосом:
  

— дополнительная хромосома 18-й пары при с. Эдвардса

— дополнительная хромосома 21-й пары при с. Дауна

• 
  аномалии числа половых хромосом:
  

— дополнительная Х-хромосома в мужской кариограмме при с. Клайнфельтера

— дополнительная Y-хромосома в мужском кариотипе при с. лишней Y-хромосомы

— нехватка Х-хпромосомы в женском кариотипе при с. Шерешевского-Тернера.

• 
  Анализ кариограммы завершается записью формулы кариотипа. Формула кариотипа включает в себя следующее:
  

б) запись сочетания половых хромосом,

в) сведения об аномалии числа хромосом (если имеется): указывают хромосому и вид аномалии. Например:

— формула кариотипа женщины, страдающей синдромом Дауна: 47, ХХ, 21+;

— формула кариотипа мужчины, страдающего синдромом Клайнфельтера: 47, ХХY,

— формула кариотипа женщины с синдромом Шерешевского-Тернера: 45, Х0.

^

Упражнение. Сделайте анализ кариограммы человека (рис.4).

Рис. 4. Кариограмма человека.

Кариограмма человека содержит 47 хромосом. Большинство хромосом расположено в порядке уменьшения их размеров. Это аутосомы. В нижнем ряду в стороне от них расположены три хромосомы. Это половые хромосомы. Все аутосомы представлены парами. Всего в кариограмме 22 пары аутосом. Половых хромосом – 3. Две из них – крупные и их первичная перетяжка – центромера – расположена почти посередине. Это Х-хромосомы. Рядом с ними находится небольшая хромосома с первичной перетяжкой, расположенной ближе к краю хромосомы. Это – Y-хромосома. Кариограмма принадлежит представителю мужского пола, так как имеется Y-хромосома. Кариограмма содержит аномалию: лишнюю Х-хромосому. Такая кариограмма характерна для особей мужского пола, страдающих синдромом Клайнфельтера: у больных отмечается евнухоидное телосложение, иногда увеличены молочные железы, слабое оволосение на лице, часто отмечается умственная отсталость, инфантилизм, они бесплодны. Формула кариотипа человека — 47, ХХY.

^

Проведите анализ следующих кариограмм.

Кариограмма 1.

Кариограмма 2.

Кариограмма 3.

Кариограмма 4.

^

6.1. Дифференциальное окрашивание хромосом

Современные цитогенетические ме­тодики позволяют идентифицировать по морфологии все пары хромосом на препарате. Суть этих ме­тодик состоит в дифференциальном окрашивании хромосом по длине, что обеспечивается сравнитель­но простыми температурно-солевыми воздействиями на фиксированные хромосомы или использованием спе­цифических красителей. Дифференциальное окрашивание при­водит к появлению линейного рисунка по длине хромосомы.

Несмотря на большое разнообразие способов обработки хромосомных пре­паратов и красителей, выявляемый ли­нейный рисунок хромосомы всегда один и тот же. Он меняется только в зависимости от степени конденсиро­ванного состояния хромосомы. Сегмент, види­мый как одна полоса в метафазной хромосоме, в менее конденсированной прометафазной хромосоме, может предстать в виде нескольких мелких полос.
Дифференциальное окрашивание в зависимости от используемого метода может охватывать либо всю длину хро­мосомы, либо ее центромерный район.
Представление о рисунке диффе­ренциально окрашенных по всей дли­не хромосом можно получить, окраши­вая препараты по G-методу с исполь­зованием красителя Гимзы (рис. 5). В этом случае хромосомы выглядят состоя­щими из поперечно-исчерченных, по-разному окрашенных сегментов. Каж­дой паре хромосом присущ индивиду­альный рисунок исчерченности за счет неодинаковых размеров сегментов. В мелких хромосомах рисунок образует­ся единичными сегментами, в крупных хромосомах сегментов много. Общее для нормального хромосомного набо­ра число окрашенных и неокрашенных сегментов в метафазе составляет около 400. В прометафазных хромосомах оно увеличивается до 850 и более.

Рис. 5. Схематическое изображение хромосом человека при G-окрашивании в соответствии с международной классификацией

^

Успехи молекулярной цитогенетики человека позволили разработать новые методы изучения хромосом. Одним из них является метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). Это метод основан на комплементарном взаимодействии ДНК изучаемого объекта с небольшой искусственной последовательностью нуклеотидов ДНК, называемой ДНК-зондом. ДНК-зонд соединен с флюоресцирующим веществом. Комплементарное взаимодействие ДНК изучаемого объекта и ДНК-зонда называется гибридизацией ДНК. Если гибридизация происходит, то это событие фиксируется люминесцентным микроскопом и свидетельствует о наличии в исследуемом образце фрагмента ДНК, комплементарного ДНК-зонду. С помощью этого метода, имея набор разных ДНК-зондов, можно даже в неделящейся клетке выявить аномалию числа хромосом и наличие патологического гена, а также выявить мелкие хромосомные мутации, которые трудно обнаружить обычными способами. При этом разные хромосомы или их участки выглядят как разноцветные структуры (рис. 6, 7).

Рис. 6. Нормальная женская кариограмма человека, полученная при использовании методики спектрального кариотипирования .

Рис. 7. Кариограмма мужчины с переносом участка 1-й хромосомы на 3-ю и потерей участка 9-й хромосомы.