Как происходит криопротокол: Схемы криопротоколов — в естественном цикле и на згт

Содержание

Криоперенос эмбрионов в СПб — Цена переноса размороженных эмбрионов при ЭКО (Криопротокол)

Криоперенос эмбрионов в СПб — Цена переноса размороженных эмбрионов при ЭКО (Криопротокол)

О процедуре

Этапы

Цены

Информация

Балтийский институт репродуктологии человека проведёт криоперенос в Санкт-Петербурге по доступной цене. Перенос замороженных эмбрионов выполняют высококвалифицированные эмбриологи и врачи-репродуктологи, гарантирующие успешную разморозку биоматериала. Клиника БИРЧ создана профессором А.И. Никитиным, под руководством которого была разработана методика искусственного оплодотворения ооцитов человека в России.

Что такое криоперенос при ЭКО

Преимущества криопереноса эмбрионов

Показания и противопоказания

Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) – репродуктивная технология, благодаря которой женщины, которые не могут забеременеть естественным способом, получают возможность познать радость материнства. Однако методика не даёт 100% гарантии, хотя эффективность её достаточно высока (в клинике БИРЧ выполняется 53% успешных ЭКО в год). Многое зависит от возраста пациентки, состояния здоровья и других сопутствующих факторов.

Для женщин репродуктивного возраста (18-30 лет) вероятность забеременеть при ЭКО составляет порядка 52%. Чем старше пациентка, тем меньше здоровых и активных яйцеклеток, тем меньше шансов на удачное проведение процедуры.Чтобы повысить шансы на успешное проведение последующих ЭКО, выполняется заморозка здоровых ооцитов или эмбрионов.

Криопротокол – процедура, при которой используют хорошие эмбрионы, полученные при первом ЭКО. Часть биоматериала замораживается и хранится в криобанке в условиях сверхнизких температур. Если экстракорпоральное оплодотворение не принесло ожидаемого результата, инициируют криопротокол – подсадку эмбрионов, оставшихся после первой программы.
В замороженном виде эмбрионы могут храниться годами.
Пациентки клиники БИРЧ имеют не только повторную возможность проведения ЭКО, но и сохраняют шанс забеременеть вторым ребёнком.

  • Более высокий шанс на успешное экстракорпоральное оплодотворение, даже если предыдущее ЭКО прошло неудачно. Чем в более раннем возрасте были взяты эмбрионы, тем выше их качество.
  • Использование качественных бластоцист даже при угасании или нарушении репродуктивной функции.
  • Сведение к минимуму числа стимуляций при искусственном оплодотворении. При повторном ЭКО стимуляция не потребуется.
  • Отсутствие необходимости повторного прохождения неприятной процедуры по забору биоматериала.
  • Возможность забеременеть в благоприятное для себя время, чтобы не пришлось делать непростой выбор между ребёнком и карьерой;
  • Минимальные риски развития осложнений;
  • Доступная стоимость крио переноса.

Применение криопротокола возможно лишь при наличии достаточного количества качественного биоматериала.

Показания к переносу эмбриона в криопротоколе:

  • Неудовлетворительное состояние эндометрия;
  • Неудачное экстракорпоральное оплодотворение;
  • Планирование повторной беременности;
  • Риски осложнений при гиперстимуляции яичников;
  • Невозможность забеременеть естественным путём;
  • Участие в программах донорства эмбрионов;
  • Заболевания органов репродуктивной системы.

Противопоказания к проведению процедуры могут быть абсолютными и относительными. К абсолютным относят:

  • Соматические заболевания, представляющие прямую угрозу здоровью и жизни пациентки;
  • Патологические изменения репродуктивных и половых органов, при которых физически невозможно выносить и родить здорового ребёнка;
  • Онкология в любой форме и локализации;
  • Психические расстройства.

Среди относительных противопоказаний выделяют:

  • Гормональный сбой;
  • Недавно перенесённые травмы или хирургические операции;
  • Заболевания мочеполовой системы и новообразования, требующие лечения.

Если в первом случае ЭКО невозможно в принципе, то при относительных противопоказаниях оплодотворение проводят сразу после устранения имеющихся проблем, например, после лечения или реабилитации.

Цены

Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ)

Перенос размороженных эмбрионов

A11.20.030

50000 р.

Пробный перенос

A11.20.009

6500 р.

Криоконсервация / хранение / расконсервация (разморозка)

Использование среды Эмбриоглю (дополнительно к стоимости переноса эмбриона (ов))

A11.20.032

16000 р.

Медицинские услуги, используемые в программах ВРТ

Инъекция спазмолитика при сложном переносе (Но-шпа)

A11.12.003

550 р.

Специалисты

Сахно Алексей Викторович

Главный врач БИРЧ.

Генеральный директор. Репродуктолог, оперирующий врач акушер–гинеколог, врач ультразвуковой диагностики, кандидат медицинских наук. Врач первой категории.

Моисеева Анна Вячеславовна

Репродуктолог, врач гинеколог-эндокринолог, специалист ультразвуковой диагностики.

Нападовский Алексей Владимирович

Руководитель лабораторного отдела. Эмбриолог.

Григорьева Валерия Александровна

Эмбриолог

Криоперенос в естественном цикле

Считается физиологически естественным и щадящим для женского организма. Чтобы повысить эффективность криопротокола в естественном цикле, рекомендуется соблюдение следующих условий:

  • Возраст пациентки не более 35 лет;
  • Имеющаяся естественная овуляция;
  • Регулярный менструальный цикл.

Для достижения положительного результата врач-репродуктолог отслеживает рост доминирующего фолликула в яичниках спустя 7 дней после начала менструации. При достижении фолликулом 15-миллиметрового диаметра дополнительно проверяет гормональный уровень жёлтого тела, пик которого приходится на период овуляции. Эта фаза считается наиболее благоприятной для подсадки эмбриона в матку.

Криопротокол в стимулированном цикле

Перенос размороженных эмбрионов в стимулированном цикле подходит, если при предыдущем ЭКО отсутствовала реакция яичников на гормонально замещающую терапию, а эндометрий был недостаточно готов к имплантации эмбриона.

Пациентке показан курс ХГЧ-терапии, чтобы подготовить слизистую оболочку матки и ускорить овуляцию. При выборе этого протокола перенос эмбрионов осуществляется после того, как эндометрий достигает нужной толщины и наступает фаза овуляции.

Криопротокол с замещающей гормонотерапией (ЗГТ)

Процедура выполняется двумя способами: с блокадой гипофиза и без. В первом случае, пациентке назначают курс лекарственных препаратов, благодаря которым исключается влияние гипофиза на репродуктивную функцию. При помощи гормонов воспроизводят фазы менструального цикла. Состояние эндотермия матки контролируют посредством УЗИ. При достижении необходимой толщины эндометрия женщине назначается прогестерон. Через 5-6 дней после приёма препарата выполняется перенос криоконсервированных эмбрионов.

ЗГТ без блокады гипофиза выполняется по аналогичному принципу, за исключением первого этапа.

Криопротокол с ЗГТ выбирают, если:

  • Возраст пациентки превышает 35 лет;
  • Отсутствует естественная овуляция;
  • Наблюдаются нарушения менструального цикла;
  • Отсутствует или слабо выражена реакция на стимуляцию яичников.

Окно имплантации

Окно имплантации – временной интервал, который оптимален для имплантации эмбриона. Речь идёт об очень небольшом промежутке времени, но от него зависит вероятность успеха при экстракорпоральном оплодотворении.

Определяется окно имплантации при помощи биопсии эндометрия с последующим исследованием материала. Проводят процедуру строго по медицинским показаниям, когда есть подозрения на патологические изменения эндометрия. Для успешного переноса замороженного эмбриона, толщина слизистой оболочки матки должна варьироваться в пределах 9-11 сантиметров.

Как выполняется перенос замороженных эмбрионов

На этом этапе проводят необходимые обследования и терапия, чтобы правильно подобрать программу криопереноса.

Витрифицированные эмбрионы размораживают за несколько часов до переноса в матку или за сутки до переноса, для пролонгации культивирования, если он был заморожен до 5х суток.

Эмбриолог проводит обязательную проверку биологического материала. Для успешного переноса у эмбриона должны быть живые клетки. После витрификации и последующей разморозки выживает до 98% замороженных эмбрионов.

Проводится химическим или механическим способом. Хетчинг предполагает прокол или истончение блестящей оболочки, в которой находится эмбрион. Процедура помогает эмбриону быстрее освободиться от естественной оболочки и успешно прикрепиться к стенке матки.

Стерильная и в большинстве случаев безболезненная процедура. Перенос эмбриона осуществляют через проводник и трансферный катетер. Процесс контролируется на мониторе с помощью аппарата УЗИ.

После завершения криопереноса пациентке рекомендуется отдохнуть в стационаре в течение 30-60 минут. Кровь на ХГЧ сдаётся спустя 2 недели после криопротокола. При соблюдении всех рекомендаций и предписаний врача, вероятность успешного ЭКО составляет 57%, что выше усреднённых показателей приживаемости эмбриона.

Стоимость криопереноса эмбриона

Сколько стоит перенос размороженных эмбрионов рассчитывается врачом-репродуктологом или эмбриологом в зависимости от выбранного типа протокола. При расчете окончательной цены учитывается общее количество анализов и обследований на подготовительном этапе, необходимость гормональной терапии и выбранного криопротокола для переноса эмбрионов.

Для определения подходящего криопротокола обязательна предварительная консультация с врачом.

Перенос криоконсервированных эмбрионов в БИРЧ

Клиника БИРЧ приглашает записаться на процедуру криопереноса по доступной стоимости. 

Наши преимущества:

Индивидуальный подход при выборе программ ЭКО и криопротокола

Отсутствие очередей

Высокая эффективность: свыше 53% успешно завершенных ЭКО ежегодно

Криопротокол входит в ЭКО по ОМС

Врачи высокой квалификации

Отзывы

Я на седьмом небе от счастья!!!!

Спасибо большое! Я на седьмом небе от счастья!!!! Огромнейшее спасибо всему Вашему коллективу!!!!! Огромное спасибо эмбриологам — Андрею Андреевичу, за то что положил начало жизни нашим крошечкам, Светлана Геннадьевне, за то что она подготовила наших крошечек к переносу после заморозки. Конечно спасибо огромное Анастасии Сергеевне за её отлично проведённую работу, чтобы сделать нас счастливыми! Вашему замечательному руководителю Алексею Викторовичу!!! Огромное спасибо Татьяне, Наталье, за тёплый приём!!!!! Ваш коллектив лучший, Вы дарите счастье!!!!!

Эко

О БИРЧ

О врачах

Новости и научная жизнь

Акции 💖

01 ноября 2022

Для наших новых пациентов 3 месяца хранения эмбрионов всего за 1 рубль!

Специальное предложение для наших новых пациентов!

Акции 💖

01 ноября 2022

Первичный прием репродуктолога по цене повторного!

Специальное предложение для наших новых пациентов!

❅

❆

❅

❆

❅

❆

❅

❆

❅

❆

❅

❆

❆

❅

❆

❆

❅

❆

❅

❆

❅

❆

❅

❆

❅

❆

❅

❆

❅

❆

❆

❅

❆

❆

❅

❆

Разница между криопротоколом и полным циклом ЭКО

Полный цикл экстракорпорального оплодотворения подразумевает несколько этапов: стимуляцию суперовуляции мощными гормональными препаратами, пункцию фолликулов под наркозом, внедрение сперматозоидов в ооциты, культивирование эмбрионов, перенос их в матку. Протокол с криоконсервированным материалом считается более щадящим, поскольку включает в себя только перенос размороженных эмбрионов.

Стоимость, питание и ощущения

Цикл с переносом криоконсервированных эмбрионов обходится гораздо дешевле, чем классическая процедура ЭКО. Во-первых, в нём меньше этапов. Во-вторых, требуется не так много препаратов (не нужно проведение терапии с использованием фолликулостимулирующих инъекций). В криоцикле, где назначена заместительная гормональная терапия, нужны витамины, лекарства для разжижения крови и препараты, помогающие уравновесить уровень эстрадиола и прогестерона. Нередко криопротокол проводится в естественном цикле, в таком случае назначаются только витамины и минимальная доза препаратов прогестерона для поддержки второй фазы цикла. В-третьих, для проведения криопереноса эмбрионов готовят только организм пациентки. Мужчина не проходит исследование, как в случае в полноценным циклом экстракорпорального оплодотворения.

Диета при классическом ЭКО и криопереносе также разнится. В первом случае женщина должна употреблять как можно больше белковой пищи (она служит источником питательных элементов для новых клеток и помогает организму на этапе стимуляции суперовуляции), отказаться от продуктов, которые вызывают повышенное газообразование (в противном случае может возникнуть ощущение тяжести в животе, что усугубит неприятные ощущения от увеличивающихся в размере яичников). Диета в цикле с замороженными эмбрионами подразумевает лишь отказ от продуктов, тяжелых для пищеварения конкретной пациентки.

Протокол с криопереносом не доставляет женщине неприятных ощущений, ведь не нужно делать многократные уколы в область живота и бедер, переживать наркоз и пункцию, нет ощущения раздутости, отсутствует риск гиперстимуляции. Посещать врача нужно реже — в среднем три раза до переноса (в коротком протоколе ЭКО — пять и более).

Различается ли результативность?

Каждый третий протокол завершается наступлением беременности — это общемировая статистика. При этом нет существенных различий в том, был это цикл с криопереносом или стимулированный. А вот рисков отмены трансфера эмбрионов в первом случае меньше. Во-первых, отсутствуют предпосылки для развития гиперстимуляции, на фоне которой перенос невозможен. Во-вторых, эмбрионы гарантированно сильные (замораживают только тех, которые имеют потенциал для дальнейшей разморозки). Из криосна успешно выходят до 99 % эмбрионов, это означает практически полную гарантию осуществления трансфера. В стимулированном цикле при слабом отклике яичников или сильном мужском факторе, например, можно получить всего пару нежизнеспособных эмбрионов. Протокол в таком случае оказывается незавершенным, перенос не назначается.

Имплантационное окно одинаково предсказуемо в стимулированном цикле ЭКО и в криопротоколе на заместительной гормональной терапии. Нет разницы между открытием этого окна и в протоколах, которые проводятся в естественных циклах. Поэтому с точки зрения простоты поиска идеального момента для переноса они одинаковы.

Объем обследований для женщины

Перед процедурами в обоих случаях нужно посетить ряд специалистов (репродуктолога и гинеколога в Краснодаре, терапевта), сдать анализы крови (на инфекции, ЗППП, гормоны, общий, клинический), мазки и бактериологические посевы, сделать пайпель-биопсию, флюорографию, ЭКГ, УЗИ органов малого таза, щитовидной и молочных желез. Лечащий врач может назначить дополнительные обследования, гистероскопию, лапароскопию.

Что точно не понадобится перед криотрансфером, так это анализ крови на антимюллеров гормон. Он позволяет оценить овариальный резерв, эта информация при наличии эмбрионов не нужна.

Если вы планируете экстракорпоральное оплодотворение, обращайтесь к нам. Наша клиника проводит прием репродуктолога и гинеколога в Краснодаре в воскресенье.

Протоколы и лучшие практики для замораживания клеток

Что такое криоконсервация? Преимущества общего протокола криоконсервацииСоветы и рекомендацииПродукты для криоконсервацииОттаивание клетокСопутствующие продукты для завершения рабочего процесса замораживания

Что такое криоконсервация?

Криоконсервация — это процесс использования низких температур для сохранения клеток и тканей для будущего использования. Этот метод включает охлаждение клеток до очень низких температур (от -80°C до -196°C) и приостановку их клеточного метаболизма, что сохраняет клетки на неопределенное время. Когда вода внутри клеток замерзает, образование льда может вызвать дисбаланс растворенных веществ и повредить клеточную структуру. Используя правильные методы и среду для замораживания, содержащую правильные криопротекторы и добавки, исследователи могут максимизировать жизнеспособность клеток после оттаивания для клеточных культур.

Зачем исследователям замораживать свои клетки?

Криоконсервация является обычной практикой в ​​исследовательских лабораториях. Хотя создание вашей лаборатории для криоконсервации может потребовать некоторых первоначальных инвестиций, преимущества замораживания ваших клеток намного перевешивают затраты, связанные с оборудованием и реагентами. Вот некоторые из преимуществ криоконсервации:

  • Сохраняет установленные и проверенные по качеству клеточные линии для использования в будущем.
  • Предотвращение изменений клеточной генетики вследствие непрерывного роста и пассирования клеток.
  • Позволяет создавать рабочие банки клеток, необходимые для обеспечения долгосрочного использования клеточной линии с воспроизводимыми результатами, а также источник резервных клеток на случай заражения или потери ваших культур.
  • Обеспечивает безопасную и удобную доставку клеточных линий.

Обзор общего протокола криоконсервации

Конкретный протокол замораживания клеток зависит от типа клеток и используемой среды криоконсервации. Чтобы заморозить интересующий вас тип ячейки, обратитесь к протоколу, рекомендованному вашим поставщиком. Типичный протокол, используемый для замораживания стволовых клеток, включает следующие этапы:

  • Соберите клетки и отцентрифугируйте их. Осторожно удалите супернатант.
  • Ресуспендируйте клетки в среде для замораживания, подходящей для вашего типа клеток.
    • Среда для замораживания, такая как CryoStor® CS10, может использоваться для большинства типов клеток. Вы также можете использовать специализированные среды, разработанные специально для определенных типов клеток. Например, используйте mFreSR™ для замораживания эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (клетки ES и iPS), среду для замораживания MesenCult™-ACF для мезенхимальных стромальных клеток (МСК) или среду для замораживания кардиомиоцитов STEMdiff™ для плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC). — производные кардиомиоцитов. Найти среды для замораживания для различных типов клеток>
  • Аликвоту клеточной суспензии в криогенные флаконы, такие как криогенные флаконы Corning® (каталожные № 100-0091, 100-0095).
  • Храните криогенные флаконы в контейнере для криогенной заморозки, содержащем изопропанол, таком как Nalgene® Mr. Frosty, или в контейнере, не содержащем изопропанол, таком как Corning® CoolCell®, и поместите их на ночь в морозильную камеру при температуре -80°C. Это позволит заморозить клетки со скоростью примерно -1°C/минуту, что идеально подходит для замораживания большинства типов клеток. Вы также можете использовать морозильную камеру с регулируемой скоростью и хранить флаконы непосредственно при температуре -80°C.
  • Перенесите криогенные флаконы в резервуар с жидким азотом для хранения при температуре -135°C.

    Примечание: Кратковременное хранение клеток (


    Рисунок 1. Типовой пошаговый протокол криоконсервации

    Различные клетки, в зависимости от их биологического строения, могут по-разному реагировать на данный протокол криоконсервации, что может повлиять на их жизнеспособность после оттаивания. Это гарантирует необходимость создания оптимизированного протокола для интересующего вас типа клеток. Чтобы замороженные клетки, полученные из разных флаконов в рабочем банке клеток, давали воспроизводимые результаты, исследователи должны строго придерживаться протокола криоконсервации. Вот несколько протоколов и технических советов по замораживанию определенных типов клеток:


    Основные рекомендации и рекомендации по криоконсервации клеток

    Успех замораживания и сохранения клеток зависит от многих элементов рабочего процесса криоконсервации. Помимо использования оптимизированного протокола и выбора правильной среды для криоконсервации для интересующего типа клеток, исследователи должны помнить о следующих передовых методах при замораживании образцов клеток:

    1. Асептические методы: замораживание ваших клеток. Хорошей практикой является протирание снаружи контейнеров, таких как колбы и флаконы с замораживающими средами, 70% этанолом или изопропанолом перед их открытием.
    2. Клетки без контаминации: Перед замораживанием убедитесь, что клетки здоровы и не содержат каких-либо микробных загрязнений. Рекомендуется включить тестирование на микоплазму в рабочий процесс перед замораживанием. Признаки заражения культуры включают помутнение среды и изменение цвета или морфологические изменения клеток.
    3. Сливающиеся клетки: Для достижения наилучших результатов клетки следует собирать во время их максимальной фазы роста (или логарифмической фазы) и перед замораживанием они должны иметь слияние более 80%.
    4. Концентрация клеток во флаконе: Оптимальная концентрация для замораживания клеток может различаться в зависимости от типа ваших клеток. В то время как замораживание клеточных суспензий при очень низкой концентрации может привести к низкой жизнеспособности клеток после оттаивания 1 , очень высокая концентрация может привести к нежелательному скоплению клеток. Как правило, концентрация клеток в криогенном флаконе находится в общем диапазоне 1×10 3 — 1×10 6 клеток/мл.

      Примечание: Вам следует попробовать заморозить клетки в нескольких концентрациях, чтобы определить, какая концентрация обеспечивает желаемую жизнеспособность, восстановление и функциональность после оттаивания.

    5. Ингредиенты среды для криоконсервации: Ингредиенты среды для криоконсервации могут оказать существенное влияние на хранящиеся в банке клетки и будущие эксперименты. Самодельная среда для замораживания обычно представляет собой культуральную среду, содержащую фетальную бычью сыворотку (FBS) с криопротектором, таким как диметилсульфоксид (ДМСО). Однако FBS содержит неопределенные компоненты, и его использование в средах для замораживания вызывает опасения по поводу изменчивости от партии к партии и риска передачи потенциально инфекционных агентов.

      Коммерчески доступные варианты, такие как CryoStor® CS10 и mFreSR™, представляют собой содержащие ДМСО готовые к использованию среды для криоконсервации, которые обеспечивают безопасную защитную среду для клеток и тканей во время процессов замораживания, хранения и оттаивания. В строго регулируемых областях, таких как клеточная и генная терапия, рекомендуется использовать полностью определенные среды для криоконсервации, произведенные в соответствии с требованиями GMP, чтобы обеспечить постоянное производство и контроль продуктов в соответствии со стандартами качества.

    6. Скорость охлаждения: Скорость, с которой клетки замораживаются, может существенно повлиять на их выживание. Замораживание с контролируемой скоростью, метод, который включает в себя постепенное охлаждение со скоростью -1°C в минуту перед длительным хранением, может помочь максимизировать жизнеспособность и целостность клеток. Замораживание с контролируемой скоростью может быть достигнуто с помощью морозильной камеры с регулируемой скоростью или путем помещения криогенных флаконов в контейнер для замораживания с изопропанолом (например, Nalgene® Mr. Frosty) или контейнер без изопропанола, такой как Corning® CoolCell®, и в -80°C. C морозильник для медленного охлаждения в течение ночи. В общем, медленное замораживание и быстрое оттаивание считаются основным правилом при замораживании и последующем восстановлении клеток.
    7. Надлежащее хранение: Выбирайте одноразовые стерильные криогенные флаконы для хранения клеток. Предпочтительно использовать криогенные флаконы с внутренней резьбой для предотвращения загрязнения во время наполнения или при хранении в жидком азоте. Найти стерильные криогенные флаконы >

      Для оптимальной работы в долгосрочной перспективе храните криогенные флаконы в резервуарах с жидким азотом (от -135°C до -196°C).

      Примечание. Элементы , хранящиеся при температуре -80°C, со временем разлагаются, поэтому не рекомендуется их длительное хранение. Это снижение жизнеспособности зависит от типа клеток, воздействия циклических температур и кратковременных явлений нагревания, таких как многократное открывание дверцы морозильной камеры.

    8. Надлежащее ведение записей: Для обеспечения прослеживаемости маркируйте криогенные флаконы всей необходимой информацией. Используйте напечатанные криоэтикетки или маркер, устойчивый как к спирту, так и к жидкому азоту. Также хорошей практикой является ведение инвентарного списка клеток в банке и запись всякий раз, когда флакон добавляется или удаляется из хранилища. Это поможет вам поддерживать достаточный запас замороженных клеток.

    Продукты для поддержки вашего рабочего процесса криоконсервации

    STEMCELL предлагает широкий выбор оптимизированных сред для замораживания, отвечающих вашим потребностям в криоконсервации различных типов стволовых клеток. Ассортимент продукции включает линии продуктов CryoStor® и BloodStor®, не содержащие сыворотку и компоненты животного происхождения, произведенные в соответствии с GMP, а также химически определенные среды для замораживания, не содержащие сыворотки, такие как mFreSR™.

    STEMCELL также предлагает специализированные среды для замораживания МСК (MesenCult™-ACF Freezing Medium), нейральных клеток-предшественников (STEMdiff™ Neural Progenitor Freezing Medium), кардиомиоцитов, полученных из чПСК (STEMdiff™ Cardiomyocyte Freezing Medium), а также для одноклеточных ЭС и iPS-клетки (FreSR™-S).

    Ознакомьтесь со всеми нашими средами для замораживания и консервации >

    Размораживание ваших криоконсервированных клеток

    Для последующей обработки криоконсервированные клетки сначала извлекаются путем оттаивания. Чтобы уменьшить влияние на восстановление клеток, рекомендуется быстро размораживать клетки. Быстрое оттаивание помогает сократить время воздействия растворенных веществ, присутствующих в замораживающей среде, а также сводит к минимуму любые повреждения, вызванные рекристаллизацией льда.

    Существуют различные методы/оборудование для размораживания клеток, включая водяную ванну, ванну с шариками, нагревание рук или специализированные инструменты, такие как ThawSTAR® CFT2. Ваш протокол оттаивания может различаться в зависимости от типа вашей клетки, и рекомендуется обратиться к протоколу, предоставленному вашим поставщиком. Вот типичный протокол для замораживания замороженных продуктов первичных клеток с использованием водяной бани 37 ° C.

    Исследователи, стремящиеся к более высокому соответствию и стандартизации, могут рассмотреть возможность использования ThawSTAR® CFT2. Эта безводная автоматизированная система размораживания обеспечивает профили размораживания клеток, аналогичные профилям водяной бани, и может разморозить ваши клетки примерно за 2,5 минуты.



    Исследуйте эти ресурсы

    Брошюра

    Среда для криоконсервации для исследований стволовых клеток

    Веб-семинар

    Круглый стол Nature Research: Стандарты хранения плюрипотентных стволовых клеток

    Веб-семинар

    Повышение воспроизводимости ваших исследований hPSC путем создания высококачественного банка клеток

    Технический совет

    Охлаждение, замораживание или фиксация клеток для проточной цитометрии или хранения

    Просмотреть все ресурсы

    1. Терри С. и др. (2010) Оптимизация протокола криоконсервации и размораживания гепатоцитов человека для использования при трансплантации клеток. Трансплантация печени 16(2): 229–37.

Морозильные камеры | Термо Фишер Сайентифик

Быстрые ссылки

  • Введение
  • Материалы
  • Информация для заказа
  • Протокол криоконсервации культивируемых клеток
  • Руководство по криоконсервации

Соответствующая информация о продукте

  • Реагенты для культивирования клеток
  • Среда для замораживания клеток

Введение в криоконсервацию культивируемых клеток

Клеточные линии в непрерывном культивировании, вероятно, будут страдать от нежелательных последствий, таких как генетический дрейф, старение и микробное заражение, и даже в самых лучших лабораториях может произойти отказ оборудования. Установленная клеточная линия является ценным ресурсом, и ее замена требует больших затрат времени и средств. Поэтому жизненно важно, чтобы они были заморожены и сохранены для длительного хранения. Правильно хранящийся запас замороженных клеток является важной частью клеточной культуры.

Как только в результате субкультивирования становится доступным небольшой излишек клеток, лучшим методом консервации является хранение их в замороженном виде в качестве посевного материала , защищенного и не доступного для общего лабораторного использования. Рабочие запасы можно приготовить и пополнить из замороженных запасов семян. Если запасы семян истощаются, то криоконсервированные рабочие запасы могут служить источником для приготовления свежего посевного материала с минимальным увеличением числа генераций по сравнению с первоначальным замораживанием.

Общий метод замораживания одинаков для прикрепленных и суспензионных клеток, за исключением того, что перед началом процедуры замораживания необходимо удалить прикрепленные клетки из культуральных планшетов. Лучшим методом криоконсервации культивируемых клеток является их хранение в жидком азоте в полной среде в присутствии криозащитного агента, такого как диметилсульфоксид (ДМСО). Криопротекторы снижают температуру замерзания среды и позволяют снизить скорость охлаждения, значительно снижая риск образования кристаллов льда, которые могут повредить клетки и вызвать их гибель.

Примечание: Известно, что раствор ДМСО облегчает процесс проникновения органических молекул в ткани. Обращайтесь с реагентами, содержащими ДМСО, используя оборудование и методы, соответствующие опасностям, создаваемым такими материалами. Утилизируйте реагенты в соответствии с местным законодательством.

Среда для замораживания
Всегда используйте рекомендуемую среду для замораживания для криоконсервации клеток. Среда для замораживания должна содержать криозащитный агент, такой как ДМСО или глицерин. Вы также можете использовать специальную среду для полной криоконсервации, такую ​​как среда для замораживания клеточных культур Gibco Recovery или среда для криоконсервации Gibco Synth-a-Freeze.

  • Среда для замораживания клеточных культур для восстановления представляет собой готовую к использованию полную среду для криоконсервации клеточных культур млекопитающих, содержащую оптимизированное соотношение эмбриональной бычьей сыворотки и бычьей сыворотки для повышения жизнеспособности клеток и восстановления клеток после оттаивания.
  • Среда для криоконсервации Synth-a-Freeze представляет собой стерильную среду для криоконсервации, не содержащую белков, с определенным химическим составом, содержащую 10 % ДМСО, подходящую для криоконсервации многих типов стволовых и первичных клеток, за исключением меланоцитов.

Материалы

  • Сосуды для культивирования, содержащие культивируемые клетки в логарифмической фазе роста
  • Полная среда для выращивания
  • Криозащитный агент, такой как ДМСО (используйте бутыль, отложенную для клеточной культуры; открывайте только в ламинарном боксе) или замораживающая среда, такая как Среда для криоконсервации Synth-a-Freeze или среда для замораживания клеточных культур для восстановления
  • Одноразовые стерильные конические пробирки на 15 или 50 мл
  • Реагенты и оборудование для определения количества жизнеспособных и общих клеток (например, Invitrogen Countess II FL Automated Cell Counter, или гемоцитометр, счетчик клеток и трипановый синий)
  • Стерильные криогенные флаконы для хранения (например, криопробирки)
  • Устройство для замораживания с регулируемой скоростью или камера с изопропанолом
  • Контейнер для хранения жидкого азота

Для замораживания прикрепленных клеток, в дополнение к вышеуказанным материалам, вам понадобятся:

3

4

4

4

  • Сбалансированный солевой раствор, такой как фосфатно-буферный раствор Gibco Dulbecco (DPBS), не содержащий кальция, магния или фенолового красного
  • Реагент для диссоциации, такой как трипсин или Gibco TrypLE Express, без фенолового красного

    • Протокол криоконсервации клеток культуры

    Видео: Замораживание клеток

    В этом видеоролике показаны важные шаги, необходимые для замораживания клеток при сохранении их оптимального состояния. Мы рассматриваем необходимое оборудование, как подготовиться к заморозке, и каждый шаг выполняется осторожно и в правильном темпе, чтобы предотвратить повреждение ваших клеток.

    Следующий протокол описывает общую процедуру криоконсервации культивируемых клеток. Для получения подробных протоколов всегда обращайтесь к вкладышу продукта для конкретной клетки.

    1. Подготовьте среду для замораживания и храните при температуре от 2° до 8°C до использования. Обратите внимание, что подходящая среда для замораживания зависит от клеточной линии.
    2. В случае прилипших клеток осторожно отделите клетки от сосуда для тканевых культур, следуя процедуре, используемой во время пересева. Ресуспензируйте клетки в полной среде, необходимой для этого типа клеток.
    3. Определите общее количество клеток и процент жизнеспособности с помощью гемоцитометра, счетчика клеток и исключения трипанового синего или автоматического счетчика клеток Countess. В зависимости от желаемой плотности жизнеспособных клеток рассчитайте необходимый объем среды для замораживания.

    4. Центрифугируйте суспензию клеток примерно при 100–200 g в течение 5–10 минут. Асептически декантируйте супернатант, не нарушая клеточный осадок.

      Примечание:   Скорость и продолжительность центрифугирования зависят от типа клеток.

    5. Ресуспендируйте клеточный осадок в холодной среде для замораживания при рекомендуемой плотности жизнеспособных клеток для определенного типа клеток.
    6. Распределите аликвоты клеточной суспензии в криогенные пробирки для хранения. Когда вы делите их на аликвоты, часто и осторожно перемешивайте клетки, чтобы поддерживать гомогенную клеточную суспензию.
    7. Заморозьте клетки в аппарате для замораживания с регулируемой скоростью, снижая температуру примерно на 1°C в минуту. В качестве альтернативы поместите криопробирки с клетками в камеру с изопропанолом и храните их при температуре –80°C в течение ночи.
    8. Перенесите замороженные клетки в жидкий азот и храните их в газовой фазе над жидким азотом.

    Руководство по криоконсервации

    Следование приведенным ниже рекомендациям необходимо для криоконсервации ваших клеточных линий для будущего использования. Как и в случае с другими процедурами культивирования клеток, для достижения наилучших результатов мы рекомендуем строго следовать инструкциям, прилагаемым к вашей клеточной линии.

    • Заморозьте образцы культивированных клеток в высокой концентрации и с как можно меньшим числом пассажей. Перед замораживанием убедитесь, что клетки жизнеспособны не менее чем на 90%. Обратите внимание, что оптимальные условия замораживания зависят от используемой клеточной линии.
    • Медленно замораживайте клетки, снижая температуру примерно на 1°C в минуту, используя криоморозильник с регулируемой скоростью или контейнер для криозамораживания, такой как «Mr. Frosty», доступный в лабораторном оборудовании Thermo Scientific Nalgene (Nalge Nunc).
    • Всегда используйте рекомендованную замораживающую среду. Среда для замораживания должна содержать криозащитный агент, такой как ДМСО или глицерин (см. Что такое пересев? ).
    • Образцы клеток следует хранить в паровой фазе жидкого азота при температуре ниже –135°C.
    • Всегда используйте стерильные криопробирки для хранения замороженных клеток. Криопробирки, содержащие замороженные клетки, можно хранить погруженными в жидкий азот или в газовую фазу над жидким азотом (см. Примечание по технике безопасности ниже).
    • Всегда используйте средства индивидуальной защиты.
    • Все растворы и оборудование, контактирующие с клетками, должны быть стерильными. Всегда используйте надлежащую стерильную технику и работайте в ламинарном боксе.

    Примечание по безопасности:  Биологически опасные материалы должны храниться в газовой фазе над жидким азотом. Хранение закрытых криопробирок в газовой фазе исключает риск взрыва. Если вы используете хранение в жидкой фазе, помните об опасности взрыва как стеклянных, так и пластиковых криопробирок и всегда надевайте защитную маску или защитные очки.

    Оставьте комментарий