Реакция на белок в кале: Реакция Требуле > Определение расворимого белка в кале > MedElement

Кальпротектин, белок массой 36,5 кДа, высвобождаемый в просвет кишечника макрофагами и нейтрофилами, полезен для определения активности заболевания и ответа на лечение при воспалительных состояниях кишечника, таких как воспалительное заболевание кишечника. Аллергия на белок коровьего молока (АБКМ) является распространенной желудочно-кишечной проблемой в младенчестве, связанной с ректальным кровотечением, рвотой, диареей и экземой.Мы предположили, что фекальный кальпротектин является полезным скрининговым тестом для оценки разрешения АБКМ у младенцев. Пилотное исследование было проведено у шести детей в возрасте до 90 дней с ректальным кровотечением и другими симптомами, характерными для аллергии на белок коровьего молока. Уровни фекального кальпротектина определяли с помощью анализа ELISA в исходном состоянии, через 3 и 6 недель после введения смеси с белковым гидролизатом. У всех младенцев клиническое улучшение и ректальное кровотечение прекратилось в течение 6 недель после перевода на смесь с гидролизатом.Исходные уровни кальпротектина в кале варьировались от 135 до 1537 мг/л (в среднем 557 мг/л) и снижались до диапазона 42-219 мг/л (в среднем 163 мг/л) через 6 недель приема смеси с гидролизатом белка. У контрольного пациента без симптомов АБКМ на протяжении всего исследования сохранялись значения кальпротектина в кале от 97 до 129 мг/л. Результаты этого пилотного исследования позволяют предположить, что фекальный кальпротектин может быть полезным скрининговым тестом для ответа на лечение формулой гидролизата белка; однако необходимы дальнейшие исследования с большим числом пациентов, чтобы определить полезность этого теста у младенцев с АБКМ.

Одновременное количественное определение клинически значимых иммунных маркеров в мазках кала новорожденных для выявления воспаления SIL) пептидные стандарты с С-концевым аргинином (R*;

Таблица 2. Параметры валидации оцениваемых протеотипических пептидов, т. е. линейность ответа, диапазон анализа, LOD и LOQ. Все концентрации в (нМ) для пептидных заменителей и в (мкг/мг) целевого белка в общем белке (по BCA) . Положение стабильного изотопом аргинина (R *; ¹³ C ₆ H ₁₄ o ₂ ¹⁵ N ₄ ; + 10 DA Shift) или лизин (K *; ¹³ C ₆ H ₁₄ O ₂ ¹⁵ N ₂ ; + 8 Да сдвиг массы) в протеотипической последовательности внутренних стандартных синтетических пептидов, выделенных жирным шрифтом.

Мазки с меконием и фекалиями

В соответствии с Хельсинкской декларацией исследование было одобрено Комитетом по этике CELSPAC: TNG (CELSPAC/EK/4/2016) в Университетской больнице Брно, Чешская Республика. Методы, использованные в исследовании и описанные ниже, применялись в соответствии с соответствующими руководствами и правилами. Авторы подтверждают, что данные, подтверждающие результаты этого исследования, доступны в статье и дополнительных материалах. Информированное согласие было получено от родителей и/или законного опекуна для всех участников исследования и заархивировано.В когортное исследование были включены только одноплодные беременности. Обученный персонал больницы собирал мазки кала у новорожденных (n = 134) в течение первого, второго или третьего дня после рождения с помощью тампонов FLOQSwabs (кат. № 520CS01, Копан, Италия). Меконий или фекалии собирали с обычного подгузника с помощью тампона, затем тампон помещали во флакон объемом 2 мл и отламывали ручку. Флакон запечатывали, немедленно помещали в морозильную камеру при температуре –80 °C и хранили до проведения преаналитической обработки и анализа образца.Объектами исследования были новорожденные женского пола (n = 56) и мужского пола (n = 78) в гестационном возрасте (недель + дней) в диапазоне от 38 + 2 до 41 + 3. до 4900 г. Образцы были взяты у новорожденных, родившихся вагинально (n = 114) или путем кесарева сечения (n = 20). Демографические и клинические характеристики всех субъектов исследования и информация о сборе образцов приведены в таблице S1.

Протокол экстракции белков

Мы осаждали белки, добавляя к образцу 1 мл 80 % IPA и орбитальное встряхивание (5 мин, 1600 об/мин).Мы центрифугировали образцы (2 мин, 12 000 × g) и удалили 50 мкл супернатанта. Остаточный объем образца (950 мкл), включая тампон, сушили в скоростном вакууме в течение ночи (минимум 6 ч). Высушенные образцы восстанавливали в 1500 мкл буфера (50 мМ ABB с 5 г/л SDC) и гомогенизировали (Benchmark Scientifics, гомогенизатор Bead Blaster 24, 4 импульса × 30 с; 4 м/с; интервал между интервалами 10 с; температура окружающей среды ). Затем мы центрифугировали образцы (3000 × g; 10 мин), переносили супернатант (500 мкл) в чистый флакон и снова центрифугировали флакон (12 000 × g; 5 мин).После второго центрифугирования супернатант (400 мкл) переносили в другой чистый флакон для расщепления экстрагированных белков трипсином. Концентрацию общего белка в 134 экстрактах мазков неонатального мекония или кала (таблица S2) оценивали в 10 мкл белкового экстракта с использованием анализа BCA (кат. № 23225). Мы подвергли белковый экстракт (50 мкл) протоколу расщепления трипсином.

Образец свежего веса с содержанием общего белка

Мы подготовили материал для контроля качества (КК), объединив образцы свежего мекония и кала от 12 случайно выбранных новорожденных.Различные количества материала для контроля качества были точно взвешены (25, 50, 75, 100, 125, 150 мг) на тампоне в трех экземплярах. Мы экстрагировали белки из мазков фекалий, как описано выше, и определили содержание белка в белковых экстрактах с помощью анализа BCA (таблица S3). Мы установили корреляцию между свежей массой образца стула и общим содержанием белка и использовали мазки для контроля качества для проверки метода и оценки воспроизводимости.

Протокол протеолиза трипсина

Мы восстановили и алкилировали белковые экстракты (50 мкл) путем добавления 5 мкл 200 мМ ДТТ (10 мин при 95°C) и последующего добавления 5 мкл 400 мМ ИУК (30 мин при температуре окружающей среды в темный).Мы добавили в образец рабочий раствор (10 мкл; 500–600 нМ) внутренних стандартов пептида SIL-TCT. Далее добавляли трипсин (3 мкл; 1 мкг/мкл) примерно в соотношении 1:70 к общему содержанию белка и инкубировали образцы при 37 ˚C (орбитальное встряхивание 200 об/мин). Мы подавили расщепление трипсином через 5 часов, добавив 200 мкл 2% FA, и пептиды очистили с помощью твердофазной экстракции (SPE, Oasis HLB prime; формат 96-луночного планшета, 30 мг; Waters, Милфорд, Массачусетс). Образцы наносили на ТФЭ, промывали 300 мкл 2% FA и элюировали 200 мкл 50% ACN с 2% FA.Элюаты ТФЭ высушивали в скоростном вакууме, восстанавливали в 50 мкл 5% ACN с 0,1% FA, что приводило к концентрациям внутреннего стандарта SIL-TCT 100–120 нМ в образце (таблица 2), и анализировали с помощью УВЭЖХ/SRM-MS.

Оптимизация времени протеолиза

Белковые экстракты из отдельно взятых мазков для контроля качества (n = 3) объединяли (1200 мкл) и делили на 21 идентичную аликвоту (50 мкл) для подготовки эксперимента с интервальной съемкой в ​​трех экземплярах. Мы не добавляли трипсин в образцы без инкубации (время 0 ч), обогащенные протеотипическими пептидами SIL (добавляли 10 мкл 1.5 мкМ смешанный рабочий раствор, все протеотипические последовательности перечислены в таблице 1). Ко всем инкубированным образцам добавляли трипсин с добавлением внутренних стандартов SIL-TCT (все протеотипические последовательности перечислены в таблице 1). Мы гасили трипсиновое расщепление через 1, 3, 5, 17, 20 и 24 часа инкубации. Ко всем образцам добавляли 2% FA (200 мкл) с последующей обработкой ТФЭ и анализом УВЭЖХ/СРМ-МС. Воспроизводимость расщепления трипсином тестировали с использованием пептидов SIL-TCT SAVQGPPER, DASGATFTWTPSSGK, TPLTATLSK, AVLTIDEK, DLQNFLK, LGHPDTLNQGEFK, ALNSIIDVYHK, DPPQYPVVPVHLDR, NQNTFLR и VVLEGGIDPILR.

Избранные анализы белков с масс-спектрометрическим мониторингом реакций

Образцы вводили (2 мкл) в систему УВЭЖХ (Agilent серии 1260, Калифорния), оснащенную аналитической колонкой (C ₁₈ Пептид CSH; 1,7 мкм, внутр. диаметр 2,1 мм × 100 мм; номер по каталогу 186006937; Уотерс, Милфорд, Массачусетс) в термостате при 40 °C. Подвижная фаза состояла из раствора А (0,1% ФК в воде) и раствора Б (0,1% ФК в АЦН). Скорость потока составляла 300 мкл/мин, а программа градиентного элюирования состояла из аналитических (0–30.9 мин) и часть повторного уравновешивания (31–35 мин): 0,0 мин 5% Б; 25 мин 30% В; 25,5 мин 95% В; 30,9 мин 95% В; 31 мин 5% В; 35 мин. 5 % B. Для соединения системы УВЭЖХ с тройным квадрупольным масс-спектрометром (AJS 6495A, Agilent, CA) использовали электрораспылитель со стандартным потоком. Источник электрораспыления работал в режиме положительных ионов (напряжение на капилляре 3,5 кВ, скорость потока газа 11 л/мин при 130 °C, давление газа в оболочке 25 фунтов на квадратный дюйм при 400 °C, напряжение на сопле 500 В). Мы отслеживали 98 переходов на анализ в динамическом режиме SRM с 2-минутным окном, запланированным для экспериментальной RT пептида.Сигнатурные переходы SRM были эквивалентны для протеотипического пептида и соответствующего внутреннего стандарта SIL, т. е. были получены один переход квантификатора SRM и 2–4 дополнительных перехода SRM квалификатора (таблица S4).

Валидация и воспроизводимость анализа белков

Мы выделили белки из всех 134 мазков мекония и фекалий, используя протокол, и объединили белковые экстракты (70 мкл) из всех отдельных образцов. Мы подготовили серию разведений, добавив пептиды SIL-TCT или SIL (10 мкл) в объединенный экстракт, и применили протокол расщепления трипсином и УВЭЖХ-SRM.Мы определили диапазон линейности, предел обнаружения (LOD), предел количественного определения (LOQ), внутридневную и внутридневную точность мультиплексного анализа белка SRM. Серия разведений включала до 9 уровней концентрации, измеренных в 3–6 технических повторностях. Для белков ECP и EDN с низким содержанием использовали отдельную калибровочную кривую. Для воспроизводимости в течение дня и в течение дня белковые экстракты готовили при семи уровнях концентрации (т. е. 0,1; 0,5; 1; 2; 4; 6 и 8 г/л) в трех повторностях, обрабатывали и анализировали в течение трех дней подряд (n = 6). каждый день).

Анализ данных

Анализы SRM были уточнены с использованием Skyline (версия 19.1.0.193; MacCoss Lab, Вашингтонский университет, Вашингтон). Мы получили интегрированные площади пиков в MassHunter (Agilent, CA), провели статистический анализ для проверки метода с помощью Excel (Microsoft Office Professional Plus, 2013) и выполнили статистический анализ в GraphPad Prism. LOD и LOQ определяли по калибровочной кривой, соответствующей матрице. Для расчета использовалось стандартное отклонение (SD) на самом низком уровне концентрации с коэффициентом вариации (CV) < 20% (n = 6), т.е.g., 3*SD, деленное на НАКЛОН (для LOD) и 10*SD, деленное на НАКЛОН (для LOQ). Коэффициент определений составил R ²  > 0,99, определение с помощью корреляции Спирмена проводили в GraphPad Prism. Критерий Манна-Уитни U использовался для сравнения двух групп в GraphPad Prism (версия 8.3.0).

Повышенный уровень фекальной пептидазы D в начале колита у мышей Galphai2-/-, мышиной модели ВЗК

Аннотация

Фон

Идентификация новых фекальных биомаркеров при воспалительном заболевании кишечника (ВЗК) затруднена из-за сложности человеческого фекального протеома.С другой стороны, в экспериментальных моделях мышей, вероятно, меньше вариаций. Мы исследовали содержание белка в кале у мышей, чтобы определить возможные биомаркеры и патогенные механизмы.

Методы

Образцы фекалий были собраны в начале воспаления у мышей Galphai2 ^-/- , хорошо описанной спонтанной модели хронического колита, и у здоровых однопометников. Фекальный протеом анализировали с помощью двумерного электрофореза и количественной масс-спектрометрии, а затем результаты подтверждали на новой группе мышей.

Результаты

Как потенциальный главный маркер заболевания, пептидаза D была обнаружена в более высоком соотношении в фекалиях мыши Galphai2 ^-/- по сравнению с контролем (кратное изменение 27; p = 0,019). Другие белки, обогащенные Gαi2 ^-/- мышей, представляли собой в основном протеазы поджелудочной железы и белки из плазмы и клеток крови. Также наблюдалась тенденция к увеличению кальпротектина, субъединицы S100-A8 (кратность изменения 21; p = 0,058). Протеазы являются потенциальными активаторами воспаления в желудочно-кишечном тракте благодаря их взаимодействию с рецептором 2, активируемым протеиназой (PAR2).Соответственно, было обнаружено, что уровень PAR2 повышен как в толстой кишке, так и в поджелудочной железе мышей Galphai2 ^-/- на разных стадиях заболевания.

Выводы

Эти результаты идентифицируют пептидазу D, повсеместно экспрессируемую внутриклеточную пептидазу, как потенциальный новый маркер колита. Повышенные уровни фекальных протеаз могут быть вовлечены в патогенез колита и способствовать клиническому фенотипу, возможно, за счет активации кишечного PAR2.

Образец цитирования: Bergemalm D, Kruse R, Sapnara M, Halfvarson J, Hörnquist EH (2017) Повышенный уровень фекальной пептидазы D в начале колита у мышей Galphai2 ^-/- , мышиная модель ВЗК.ПЛОС ОДИН 12(3): е0174275. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0174275

Редактор: Адам Леснер, Uniwersytet Gdanski, POLAND

Поступила в редакцию: 19 декабря 2016 г.; Принято: 6 марта 2017 г .; Опубликовано: 21 марта 2017 г.

Авторское право: © 2017 Bergemalm et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и в его файле вспомогательной информации.

Финансирование: DB сообщает о грантах исследовательского фонда Бенгт Ихре (http://ihrefellowship.se) и грантах региона Эребру (http://www.fou.nu/is/oll/forskningskommitten, OLL-526131). ), во время проведения исследования. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Компания DB получила дополнительные гранты от окружного совета Эребру, фонда Лизы и Йохана Гронбергов и фонда Mag-tarm.EHH получил дополнительные гранты от Шведского онкологического общества. Спонсоры этих грантов для другой работы не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. JH сообщает о личных вознаграждениях от Abbvie, личных вознаграждениях от Hospira, личных вознаграждениях от Janssen-Cilag, личных вознаграждениях от Medivir, личных вознаграждениях от MSD, личных вознаграждениях от RenapharmaVifor, личных вознаграждениях от Takeda, и все это не относится к представленной работе. Это не меняет нашей приверженности политике PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), в основном язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК), представляет собой потенциально разрушительное заболевание, поражающее людей всех возрастов. ВЗК имеет пик начала у молодых людей и часто характеризуется хроническим течением с обострениями и бессимптомными периодами [1]. Сочетание раннего начала и ожидаемой нормальной продолжительности жизни означает высокую степень накопленной заболеваемости и значительных затрат. Постановка диагноза и мониторинг заболевания традиционно основывались на клинических параметрах, эндоскопической оценке, визуализации и неспецифических маркерах крови, таких как С-реактивный белок, гемоглобин и альбумин.В последние годы было показано, что фекальные маркеры, такие как кальпротектин, позволяют различать функциональные расстройства и ВЗК, а недавно было предложено использовать их в качестве надежных маркеров для раннего выявления рецидива и выявления пациентов с повышенным риском обострения в будущем [2, 3]. Концепция использования новых фекальных белковых маркеров, например, для диагностики, мониторинга тяжести заболевания и эффективности лекарств, является многообещающей, поскольку она будет неинвазивной и легкодоступной. Однако можно ожидать, что различия в потреблении пищи и кишечной микробиоте между людьми вызовут высокую степень сложности фекального протеома [4].Эти опасения могут препятствовать открытию новых маркеров, особенно когда они выполняются на людях, даже несмотря на то, что в последнее время сообщалось о некоторых достижениях [5]. Напротив, модели лабораторных мышей имеют контролируемую среду с минимальными вариациями в пище и воздействием бактерий, поэтому можно ожидать, что они будут иметь менее изменчивые фекальные протеомы.

Нокаут гетеротримерной субъединицы G-белка Galphai2 у мышей приводит к фенотипу, в котором доминирует тяжелый и хронический колит, напоминающий ВЗК [6].Летальное воспаление у мышей с фоном 129Sv начинается с 6–12-недельного возраста и включает кровавый понос, вздутие толстой кишки, перитонит, дисплазию слизистой оболочки и колоректальный рак, тогда как у мышей с фоном C57Bl/6 колит отсутствует. Воспаление характеризуется провоспалительными Th2-лимфоцитами на поздних стадиях заболевания [7], но у мышей до появления симптомов наблюдаются другие изменения, включая повышенное количество антител к комменсальной микробиоте, продуктам питания и собственным тканям, включая перинуклеарные антинейтрофильные антитела. цитоплазматические антитела (p-ANCA) [8, 9].Клетки Galphai2 ^-/- , полученные из костного мозга, опосредуют колит, что было показано реципрокным переносом костного мозга между Galphai2 ^-/- и мышами дикого типа [10]. Более свежие данные, полученные нами, выявили раннее и резкое усиление цитокиновых ответов, связанных с Th27, а также изменения микробиоты, связанные со степенью воспаления в модели Galphai2 ^-/- [11, 12].

Proteomics — идеальный метод для идентификации ранее неизвестных белковых маркеров.Влияние колита на фекальный протеом еще не было проанализировано в контролируемой системе, такой как лабораторная модель мыши. Лишь в нескольких исследованиях был проанализирован фекальный протеом лабораторных мышей, но, насколько нам известно, никогда в контексте ВЗК [4, 13, 14]. Кроме того, поскольку у всех мышей Galphai2 ^-/- в конечном итоге развивается колит, можно исследовать мышей, предрасположенных к заболеванию, но все еще находящихся в предсимптомной фазе.

В настоящем исследовании мы стремились исследовать любые изменения в фекальном протеоме, вызванные нокаутом Galphai2 , чтобы идентифицировать возможные биомаркеры и лучше понять патогенные события, которые вызывают проявления, связанные с ВЗК, в этой модели.

Материалы и методы

Животные

Galphai2 ^-/- мыши с чистым фоном 129SvEv были выведены с использованием гетерозиготных (Galphai2 ^+/- самцов и самок). Животные содержались в Отделе экспериментальной биомедицины Гетеборгского университета. Полимеразная цепная реакция на геномной ДНК хвост использовали для подтверждения гомозиготности.У гетерозиготных (Galphai2 ^+/- ) или животных дикого типа не развивался явный фенотип, и они имели нормальную продолжительность жизни. У гомозиготных животных примерно в шестинедельном возрасте развилась тяжелая диарея, и в течение нескольких недель они умерли от колита. За мышами ежедневно наблюдали опытные зоотехники, у которых есть устная и письменная информация об этом конкретном генотипе и симптомах болезни, и их подвергали эвтаназии, если у них наблюдалось ухудшение общего состояния, такое как торчащий мех и/или изменение социального поведения, или если они потеряли больше не более 15 % массы их тела. Их разводили и содержали в клетках микроизолятора с фильтром, во всех случаях в сопровождении других мышей.Они получили экологическое обогащение в виде, например, гнездовые подушечки, корм и воду давали вволю. Ни одна из мышей в исследовании не умерла без эвтаназии в результате тяжелого колита. Мышей не подвергали эвтаназии для сбора фекалий. Мышей с симптомами тяжелого колита, как описано выше, подвергали эвтаназии путем смещения шейных позвонков с последующим удалением сердца. Мыши были проверены на здоровье в соответствии с рекомендациями Федерации европейских лабораторных ассоциаций животных (FELASA), и Комитет по этике животных Гетеборгского университета одобрил исследование.

Гомогенизация тканевых и фекальных гранул

Белки из фекальных гранул экстрагировали, как описано ранее, с некоторыми модификациями [4]. Вкратце, фекальные гранулы от самцов и самок мышей Galphai2 ^-/- собирали при подозрении на начало заболевания и до появления каких-либо явных клинических признаков заболевания (4–5 недель) для протеомики. Фекальные гранулы от четырехнедельных мышей были просты в обращении и гомогенизировались по отдельности. Для проверочных экспериментов белки также экстрагировали из фекалий мышей с манифестным колитом (возраст 6–12 недель).Отбор проб отдельных фекальных гранул у нескольких мышей с симптоматическим колитом осложнялся диареей, но для экстракции белка всегда использовалось одинаковое количество буфера по отношению к массе фекалий. Погадки от однопометников дикого типа и Galphai2 ^+/- собирали аналогичным образом в том же возрасте. Чтобы свести к минимуму экспериментальные отклонения, мы собирали только свежеприготовленные гранулы. Это было обеспечено перемещением отдельных животных в новые клетки для сбора образцов. Все гранулы сразу же хранили при температуре -80°С.Перед гомогенизацией фекальные осадки взвешивали и помещали в разведение 1:10 (г/мл) раствора мочевины (8 М мочевина, 2 М CHAPS) для двумерного электрофореза или Трис-буфер (20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 1% Triton X-100) для количественной масс-спектрометрии и иммуноблоттинга. Все образцы были обработаны коктейлем ингибиторов протеаз (Sigma Aldrich), поскольку высокие уровни протеаз связаны с колитом [15, 16]. Осадки разрушали вручную с помощью наконечника пластиковой пипетки перед гомогенизацией с использованием Ultraturrax (IKA, Stufen, Germany).

Белковые экстракты из толстой кишки и поджелудочной железы для иммуноблоттинга готовили аналогичным образом в Трис-буфере с использованием Ultraturrax. Затем гомогенаты центрифугировали при 20 000 g для осаждения нерастворившегося материала, а собранные надосадочные жидкости перед анализом хранили при -80°C. Общее содержание белка в образцах фекального белка определяли с помощью анализа белка DC (Bio-Rad, Hercules, CA, США) или набора 2D Quant (GE Healthcare, Уппсала, Швеция). Концентрация белка обычно составляла около 2–2.5 мг/мл с тенденцией к несколько более низкой концентрации у мышей Galphai2 ^-/- .

Двумерный гель-электрофорез (2DE)

Чтобы получить общее представление о распределении белка, вариации отдельных образцов и полуколичественных измерений отдельных белковых пятен, был проведен двумерный гель-электрофорез, как описано ранее [17]. 30 мкг отдельных образцов белка фекалий от четырехнедельных животных Galphai2 ^-/- , без признаков колита или только с ранними признаками, а также аналогичные образцы белка от здоровых животных того же возраста Galphai2 ^+/- и фон дикого типа, снабжали буфером IPG с pH 3-11NL (GE Healthcare) до конечной концентрации 0.5% и буфер для регидратации (8 М мочевина, 2% CHAPS и 0,002% бромфеноловый синий) до конечного объема 200 мкл. Образцы загружали и регидратировали в 11-сантиметровые полоски 3-11NL IPG (GE Healthcare) в течение 12–16 часов. Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) выполняли с использованием ячейки Protean IEF (Bio-Rad) при 20°C, а максимальный ток устанавливали на 50 мкА на полоску с пошаговым увеличением напряжения до достижения 11 000 вольт-часов. После IEF полоски уравновешивали в течение 15 минут в уравновешивающем буфере (6 М мочевина, 50 мМ Трис-HCl, pH 8.8, 30% (об./об.) глицерина, 2% SDS и 0,002% бромфенолового синего), содержащего 1% дитиотреитола, а затем в течение 15 мин с 2,5% йодацетамида в том же буфере. Электрофорез второго измерения проводили в системе электрофореза Criterion ^TM Cell (Bio-Rad). Полоски IPG помещали поверх акриламидных гелей с градиентом 10–20% (масса/объем) (Bio-Rad) и запечатывали 1% расплавленной агарозой в подвижном буфере SDS. Гели запускали при 20°С и 200 В в течение одного часа. Для анализа их окрашивали флуоресцентным красителем Oriole™ (Bio-Rad) и возбуждали УФ-светом с использованием устройства для визуализации Chemidoc XRS (Bio-Rad) с эмиссионным фильтром при 580 нм.

Количественная масс-спектрометрия (QMS) с использованием тандемных масс-меток (TMT)

Подготовка проб для масс-спектрометрического анализа.

Белки экстрагировали из фекалий трех 4-недельных животных Galphai2 ^-/- с ранними признаками колита и однопометников дикого типа, сопоставимых по возрасту, путем гомогенизации в экстракционном буфере (20 мМ Трис-HCl и 1 % Triton X-100), содержащий смесь ингибиторов протеазы (Sigma Aldrich). Общее содержание белка определяли с помощью теста Pierce™ BCA Protein Assay (Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).Образцы (45 мкг) восстанавливали добавлением 2М DL-дитиотреитола до конечной концентрации 100 мМ и инкубировали при 60°С в течение 30 мин. Образцы были расщеплены трипсином с использованием метода подготовки образцов с фильтрацией (FASP), модифицированного Wisniewski et al [18]. Вкратце, восстановленные образцы наносили на фильтры Nanosep 10k Omega (Pall Life Sciences) и многократно промывали 8 М мочевиной. Алкилирование проводили метилметантиосульфонатом (ММТС), разведенным в буфере для расщепления (1% дезоксихолат натрия и 20 мМ TEAB) в течение 20 мин при комнатной температуре с последующей промывкой буфером для расщепления.Трипсин (трипсиновая протеаза Пирса, класс MS; Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) в соотношении 1:100 по отношению к содержанию белка добавляли в 50 мМ TEAB до pH около 8, и образцы инкубировали в течение ночи при 37°С. Добавляли еще одну порцию трипсина и смесь инкубировали при 37°С в течение трех часов. Пептиды собирали центрифугированием и подвергали реагенту для мечения изобарической массы, TMT®, в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Scientific). После мечения ТМТ образцы объединяли и подкисляли муравьиной кислотой для осаждения дезоксихолата натрия.

Пептиды дополнительно очищали и фракционировали с помощью сильной катионообменной хроматографии (ÄKTA-system; Amersham-Pharmacia) на колонке PolySULFOETHYL A™ (100 × 2,1 мм, 5 мкм, 300 Å; PolyLC Inc. ). Растворитель А представлял собой 25 мМ формиата аммония, рН 2,8, а растворитель В представлял собой 500 мМ формиата аммония, рН 2,8. Градиент работал со скоростью 0,25 мл/мин; 20% растворителя B в течение 20 минут, 40% растворителя B в течение 10 минут и, наконец, 100% растворителя B в течение 10 минут. Всего было собрано 28 фракций, и 22 фракции, содержащие пептиды из каждого набора, были обессолены с использованием спин-колонок PepClean C18 (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с рекомендациями производителя.

Анализ ЖХ-МС/МС.

Высушенный, обессоленный 10-плексированный образец, меченный ТМТ, был восстановлен 15 мкл 0,1% муравьиной кислоты (Sigma Aldrich) в 3% ацетонитриле и проанализирован на масс-спектрометре Orbitrap Fusion Tribrid, соединенном с Easy-nLC II (Thermo Fisher научный). Пептиды (вводимый объем 2 мкл) разделяли с использованием аналитической колонки собственной конструкции (внутренний диаметр 300 × 0,075 мм), заполненной частицами Reprosil-Pur C18-AQ размером 1,8 мкм (Dr. Maisch, Германия).Растворитель А представлял собой 0,2% муравьиной кислоты в воде, а растворитель В представлял собой 0,2% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Использовали следующий градиент со скоростью 200 нл/мин: 5–30 % растворителя B в течение 75 мин и 30–80 % растворителя B в течение 5 мин с окончательной выдержкой при 80 % растворителя B в течение 10 мин. Ионы вводили в масс-спектрометр при напряжении распыления 1,6 кВ в режиме положительных ионов. МС сканирование проводили с разрешением 120 000, диапазон m/z 350–1500. Анализ МС/МС выполняли в многоканальном режиме, зависящем от данных, с циклом максимальной скорости 3 с для наиболее интенсивных двух- или многозарядных ионов-предшественников.Ионы в каждом MS-сканировании с пороговым значением 5000 были отобраны для фрагментации (MS2) с помощью диссоциации, индуцированной столкновениями (CID), для идентификации на уровне 30% и обнаружения в ионной ловушке с последующей многоступенчатой ​​(одновременной) изоляцией 10 верхних ионов фрагментов MS2 с m/z 400–900, выбрано для фрагментации (MS3) методом диссоциации столкновений высоких энергий (HCD) при 55% и детектировании в Orbitrap с разрешением 60 000, диапазон m/z 100–500. Прекурсоры выделяли в квадруполе с окном m/z 1,6, а динамическое исключение в пределах 10 ppm в течение 30 с использовали для значений m/z, уже выбранных для фрагментации.

Обработка данных и количественный анализ.

Файлы необработанных данных МС для каждого набора TMT были объединены для относительного количественного определения и идентификации с использованием Proteome Discoverer версии 1.4 (Thermo Fisher Scientific). Поиск в базе данных для каждого набора был выполнен с помощью поисковой системы Mascot (Matrix Science) с использованием базы данных Mus musculus Swissprot Database, ноябрь 2014 г. (Швейцарский институт биоинформатики, Швейцария) с допуском МС пептидов 10 ppm и допуском МС/МС для идентификации. 500 миллимассовых единиц (ммм).Принимали триптические пептиды с нулевым пропущенным расщеплением и вариабельными модификациями окисления метионина и алкилирования цистеина, а также отбирали фиксированные модификации N-концевой ТМТ-метки и лизиновой ТМТ-метки. Порог обнаруженного пептида в программном обеспечении был установлен на 1% False Discovery Rate путем поиска в обращенной базе данных, а идентифицированные белки были сгруппированы путем использования одних и тех же последовательностей для минимизации избыточности. Для количественного определения ТМТ использовали отношения интенсивностей репортерных ионов ТМТ в спектрах HCD MS/MS (m/z 126–131) из исходных наборов данных.Соотношения были получены с помощью Proteome Discoverer с использованием следующих критериев: устойчивость к фрагментным ионам как 3 мкМ для наиболее достоверного центроидного пика, а отсутствующие значения заменены минимальной интенсивностью. Для относительного количественного определения учитывались только пептиды, уникальные для данного белка, за исключением пептидов, общих для других изоформ или белков того же семейства. Количественное определение нормализовали, используя влажную массу фекалий и общую концентрацию белка. Отсутствующие белки от отдельных животных были заменены фоновым значением, оцененным по шуму. Для количественного анализа спектры MS3 оценивали вручную.

Иммуноблоттинг

Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) проводили в соответствии со стандартными процедурами. Вкратце, такое же количество мкг отдельных образцов белка снабжали буфером Лэммли (2% ДСН, 5% 10-меркаптоэтанола, 10% глицерина, 0,002% бромфенолового синего, 62,5 мМ трис-HCl, рН 6,8) и загружали в каждую лунку в течение разделение на предварительно приготовленных полиакриламидных гелях Criterion с градиентом 10–20% (Bio-Rad) и последующее электроблоттирование на поливинилидиндифторидных мембранах (GE Healthcare).Блоты исследовали моноклональным первичным антителом против трипсина (1:1 000; Abcam, Кембридж, Великобритания), моноклональным первичным антителом против PAR2 (1:2 000; Abcam) или поликлональным антителом против PEPD (1:500; Sigma Aldrich). затем вторичное антитело против мышиного IgG или против кроличьего IgG, связанное с пероксидазой хрена (разведение 1:100 000; GE Healthcare), и визуализировали с помощью хемилюминесценции с использованием ECL prime (GE Healthcare). Полосы были захвачены с помощью устройства для формирования изображений Chemidoc XRS (Bio-Rad), а количественный анализ денсиометрии был выполнен с использованием программного обеспечения Image Lab v.5.0 (Био-Рад).

Статистический анализ и аннотация функции белка и его субклеточной локализации

Критерий Стьюдента использовали для статистического анализа количественной масс-спектрометрии. Статистическая значимость была установлена ​​на уровне p < 0,05, а биологическая значимость была установлена ​​на уровне кратности ≥ 2 между группами или ≥ 2 по сравнению с фоновым шумом.

Индивидуальные денсиометрические данные иммуноблотов были разделены на среднее значение уровней белка у мышей дикого типа или у мышей до появления симптомов, как указано на каждом рисунке.Эти относительные значения белка были импортированы в SPSS версии 22 (IBM) для статистического сравнения с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни.

Для анализа функциональных и субклеточных компартментов использовалась база знаний программного обеспечения Ingenuity Pathway Analysis (5 декабря 2015 г. ) [19] вместе с информацией из базы знаний UniProt [20] и Атласа белков человека [21].

Результаты

Выделение фекального белка

Все мыши Galphai2 ^-/- родились здоровыми, и у них появились явные признаки колита (диарея, кровь в стуле) в возрасте 5-6 недель, как описано ранее [22].Для идентификации белковых маркеров, отражающих начало заболевания, образцы фекалий брали в возрасте от четырех до пяти недель. В этом возрасте у мышей не было признаков колита, но фекальные шарики были немного мягче. Можно предположить, что этот момент времени соответствует моменту, когда пациентов с подозрением на ВЗК направляют к специалисту, и поэтому может иметь клиническое значение для определения возможных диагностических маркеров.

Протеомный анализ

Двумерный электрофорез.

Фекалии мышей Galphai2 ^-/- , здоровых мышей Galphai2 ^+/- и однопометников дикого типа гомогенизировали, и белки разделяли с помощью 2DE (рис. 1).

Рис. 1. Двумерный электрофорез образцов белка фекалий мышей Galphai2 ^-/- , мышей Galphai2 ^+/- и однопометников дикого типа.

Образцы анализировали на гелях с широким охватом изоэлектрических точек (3–11) и молекулярных масс. В гелях от мышей Galphai2 ^-/- преобладали несколько пятен высокой интенсивности, которые заметно отличались от их гетерозиготных однопометников и однопометников дикого типа.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0174275.g001

Гели показали воспроизводимый рисунок пятен, хотя и немного слабее, чем ожидалось, исходя из нанесенного количества общего белка. В среднем около 400 отдельных белковых пятен были обнаружены в образцах фекалий здоровых мышей Galphai2 ^+/- и однопометников дикого типа, тогда как у мышей Galphai2 ^-/- было несколько меньше пятен при разделении 2DE.

Количественная масс-спектрометрия.

Для идентификации и количественного определения потенциальных биомаркеров мы затем проанализировали другой набор образцов фекалий от четырехнедельных мышей Galphai2 ^-/- и мышей дикого типа с помощью QMS. Мы решили сосредоточиться только на белках-хозяевах, поэтому поиск данных был выполнен в базе данных протеома мыши для идентификации белков. Всего было идентифицировано 120 мышиных белков; десять из этих белков были уникальными для образцов фекалий мышей Galphai2 ^-/- , тогда как только один белок был уникальным для здоровых однопометников (таблица S1). Однако разница в уровнях отдельных белков между двумя группами превышала кратное изменение +/- 2 и была статистически значимой только для десяти белков, а семь других белков оказались погранично значимыми (таблица 1).Интересно, что концентрация пептидазы D (дипептидазы Xaa-Pro) была высокой в ​​фекалиях мышей Galphai2 ^-/- , но не могла быть обнаружена ни у одной из мышей дикого типа, что соответствует 27-кратному увеличению Galphai2 ^{— /-} мышей относительно наблюдаемого фонового шума у ​​здоровых однопометников (p = 0,019). Возможное увеличение белка S100-A8 (кратность изменения = 21, p = 0,058), известного как одна из субъединиц кальпротектина, можно наблюдать у мышей Galphai2 ^-/- по сравнению с мышами дикого типа (таблица 1). .

Анализ данных

Субклеточное происхождение.

Все фекальные белки (n = 120), идентифицированные с помощью QMS, были дополнительно проанализированы с помощью IPA. Результаты показывают, что белки происходят из разных субклеточных компартментов (рис. 2). Большинство белков были классифицированы как внутриклеточные (цитозольные или ядерные), 48%, и в меньшей степени как происходящие из плазматической мембраны (25%) или секретируемые (27%).

Функциональные группы белков.

Для классификации фекальных белков, содержание которых было значительно (p<0.05) или, возможно, (p = 0,05–0,1) изменены (n = 17) у мышей Galphai2 ^-/- в соответствии с функцией и тканью происхождения, Ingenuity Pathway Analysis [19], базой данных UniProt [20] и использовали Атлас белков человека [21] (табл. 1). Семь из 13 белков с более высокими концентрациями в фекалиях мышей Galphai2 ^-/- были отнесены к пищеварительным, причем большинство из них (n = 5) были протеазами (табл. 1). Среди протеаз наиболее заметным открытием было значительное повышение уровня пептидазы D.Два белка, транстиретин (р = 0,003) и серотрансферрин (р = 0,087), были взяты из плазмы. Другие белки имели различные функции и не могли быть легко классифицированы в общие группы (таблица 1).

Валидация

Пептидаза D как маркер колита.

Для проверки пептидазы D в качестве потенциального маркера колита были собраны фекалии новых когорт мышей Galphai2 ^-/- и однопометников дикого типа, а белковые экстракты были подвергнуты иммуноблотингу с использованием антитела к пептидазе D (рис. 3) .

Рис. 3. Иммуноблоты пептидазы D.

Новый набор образцов фекального белка от Galphai2 ^-/- мышей и здоровых однопометников подвергали иммуноблотингу для обнаружения пептидазы D. Равные количества фекального белка загружали из пяти Galphai2 ^-/- мыши на разных стадиях колита. Первые две дорожки (слева) были от 4-недельных мышей до появления симптомов, тогда как дорожки 3–5 были от 7-, 10- и 7-недельных мышей с манифестным колитом. Здоровым мышам на момент сбора образцов было всего 4 недели.На прямоугольной диаграмме показан денситометрический количественный анализ блотов, где уровни пептидазы D у мышей Galphai2 ^-/- представлены относительно среднего значения у здоровых однопометников дикого типа. а.е. = произвольные единицы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0174275.g003

Результаты соответствовали данным QMS, но у одной из мышей Galphai2 ^-/- сигнал был слабее — с интенсивностью, аналогичной к таковому в фекалиях мышей дикого типа. Однако эта мышь была старше других мышей и страдала тяжелым колитом, что могло повлиять на результаты.В отличие от QMS, в образцах от мышей дикого типа также была обнаружена слабая полоса, что указывает на то, что низкий уровень белка пептидазы D является частью нормального фекального протеома.

Фекальные протеазы.

Самой большой функциональной группой измененных белков в фекалиях Galphai2 ^-/- были протеазы. Повышенное количество панкреатического трипсина сериновой протеазы последовательно связывают с ВЗК [15, 16]. Хотя уровень/содержание панкреатического трипсина не был значительно повышен в наших анализах QMS, мы оценили количество трипсина-2 в фекалиях мышей Galphai2 ^-/- , мышей Galphai2 ^+/- и однопометников дикого типа с помощью иммуноблот (рис. 4).

Рис. 4. Иммуноблоты трипсина-2.

Образцы белка фекалий от мышей Galphai2 ^-/- , мышей Galphai2 ^+/- и однопометников дикого типа подвергали иммуноблотингу для обнаружения трипсина-2. (A) Были загружены равные количества фекального белка от мышей Galphai2 ^-/- с ранними признаками колита, а также образцы от мышей Galphai2 ^+/- и однопометников дикого типа того же возраста. (B) Образцы фекального белка от мышей Galphai2 ^-/- на разных стадиях колита показали тенденцию к более высоким уровням трипсина при прогрессирующем заболевании.На диаграммах показан денситометрический количественный анализ блотов, где уровни трипсина-2 у мышей Galphai2 ^-/- были изображены относительно среднего значения здоровых однопометников дикого типа (A) или мышей Galphai2 ^-/- до появления симптомов ( Б). а.е. = произвольные единицы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0174275.g004

В целом уровни трипсина-2 были выше в фекалиях мышей с симптомами Galphai2 ^-/- , чем в фекалиях мышей дикого типа и до -симптоматические мыши.Известно, что сериновая протеаза и другие протеазы взаимодействуют и активируют протеиназно-активируемый рецептор-2 (PAR2) в желудочно-кишечном тракте [23, 24]. Предполагается, что это способствует патогенезу ВЗК [23, 25, 26]. Чтобы исследовать этот механизм у мышей Galphai2 ^-/- , мы оценили количество и распределение PAR2 в толстой кишке мышей на разных стадиях заболевания с использованием антитела против PAR2 (фиг. 5A).

Рис. 5. Иммуноблоты PAR2 гомогенатов ткани толстой кишки и поджелудочной железы мышей Galphai2 ^-/- и здоровых однопометников.

Чтобы изучить возможное влияние повышенного количества люминальных протеаз на уровни PAR2, все образцы мышей Galphai2 ^-/- , загруженные в гели, были получены от мышей с различными стадиями клинически наблюдаемого колита (> 5 недель). A. PAR2 в гомогенатах толстой кишки Galphai2 ^-/- и мышей дикого типа. Полоса с несколько более низкой молекулярной массой представляла собой перекрестно реагирующий белок вторичного антитела против мыши и была исключена из денситометрического количественного определения. Б. PAR2 в гомогенатах поджелудочной железы Galphai2 ^-/- и мышей дикого типа. По сравнению с Galphai2 ^-/- сигнал PAR2 был слабым у мышей дикого типа. На диаграммах показан денситометрический количественный анализ блотов, где уровни PAR2 у мышей Galphai2 ^-/- представлены относительно среднего значения у здоровых однопометников дикого типа. а.е. = произвольные единицы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0174275.g005

В толстой кишке уровни PAR2 были одинаковыми у отдельных животных дикого типа, тогда как различия были больше у отдельных мышей Galphai2 ^-/- .В среднем у мышей Galphai2 ^-/- уровни PAR2 были примерно в три-четыре раза выше. Также известно, что PAR2 экспрессируется в ацинарных клетках поджелудочной железы, где активация рецептора участвует в высвобождении ферментов поджелудочной железы [26, 27]. Поэтому мы подвергли гомогенаты поджелудочной железы мышей Galphai2 ^-/- с симптомами иммуноблотингу с использованием антитела против PAR2 (фиг. 5B). У мышей Galphai2 ^-/- уровни PAR2 были явно повышены (со средним кратным изменением примерно в 8 раз), но с различиями между отдельными мышами.

Обсуждение

Насколько нам известно, это исследование является первым протеомным анализом фекалий в мышиной модели ВЗК. Мы идентифицировали потенциальный новый фекальный биомаркер, пептидазу D, которая была обнаружена в фекалиях мышей Galphai2 ^-/- даже в более высоких относительных количествах, чем белок S100-A8, который является частью комплекса кальпротектина. В соответствии с предыдущими исследованиями мы также наблюдали повышенный уровень фекальных протеаз и активацию тканевого PAR2. Активация PAR2 может привести к воспалительным реакциям как части патогенеза ВЗК.

Наши данные 2DE показали, что фекальный протеом мышей Galphai2 ^-/- содержал меньше белковых пятен, чем мыши дикого типа. Это может быть связано с повышенным уровнем просветных протеаз и, таким образом, с усилением деградации белков. Однако вариации концентрации общего белка в гомогенатах фекалий были довольно небольшими (2–3 мг/мл, что аналогично тому, что можно было бы ожидать от препаратов тканей), независимо от выбранного метода количественного определения. Как по данным 2DE, так и по QMS, уровни отдельных белков и оценочные количества общего белка были многократно ниже, чем ожидалось, исходя из того, что теоретически применялось при измерении концентрации общего белка в экстрактах фекалий.Причина этого несоответствия неясна, но частично это может быть связано с большим количеством небольших, частично деградированных пептидов, выходящих за пределы диапазона протеомного анализа. Мы также могли ожидать, что значительная часть фекальных белков была получена из микробиоты или переваренной пищи и, следовательно, не была идентифицирована при поиске в базе данных мышей.

Фекальный протеом мышей ранее исследовали на предмет выявления возможных биомаркеров колоректальных аденом [13]. Энг и др.идентифицировали 115 белков мышиного происхождения, что было аналогично количеству белков, идентифицированных в настоящем исследовании. Примерно треть белков, идентифицированных в их модели, совпала с результатами нашего исследования. Лихтман и др. нанесли на карту разнообразие фекального протеома в ответ на различную микробиоту и сообщили об основном фекальном протеоме из 68 белков [4]. Двадцать восемь из этих 68 «коровых» белков были идентифицированы в нашем наборе данных, но ни один из белков, уникальных для мышей Galphai2 ^-/- , не рассматривался как часть основного протеома.В нашем исследовании белки, предположительно секретируемые или внеклеточные, составляли только 27% идентифицированных белков, что ниже, чем можно было ожидать из более ранних исследований [13]. Явное увеличение просветных белков внутриклеточного происхождения (рис. 2) может быть связано с повреждением слизистой оболочки у мышей Galphai2 ^-/- , страдающих воспалением, несмотря на наличие минимальных клинических признаков заболевания, но также может быть связано с инфильтративными лейкоцитами. . Небольшое совпадение между моделью Galphai2 ^-/- и предыдущими исследованиями мышиных моделей колоректального рака, вероятно, связано с различиями, характерными для мышиных моделей.Однако влияние возможных различий, характерных для животноводческих помещений, также может повлиять на вариацию.

Пептидаза D представляет собой внутриклеточную пептидазу, в первую очередь участвующую в деградации коллагена, но в некоторой степени также и в пищевых белках — для утилизации аминокислоты пролина. Известно, что мутации зародышевой линии, вызывающие потерю активности белка, приводят к дефициту пролидазы при рецессивно-наследственном заболевании [28]. Белок активируется посредством фосфорилирования и регулируется в основном посредством передачи сигналов интегрина β1 и коллагена-1 [29, 30].Как пептидаза D оказывается в просвете кишечника и кале, неясно; это, конечно, может происходить в результате активного транспорта или в виде остатков некротизированных клеток слизистой оболочки. Потенциал пептидазы D как фекального маркера колита должен быть подтвержден дальнейшими исследованиями на людях, что выходит за рамки данного исследования. Пептидаза D, однако, кажется многообещающим маркером, поскольку мы обнаружили, что этот белок имеет даже более высокое отношение сигнал/шум, чем белок S100-A8, в начале заболевания.

На вопрос о том, что вызывает воспаление у мышиной модели Galphai2 ^-/- , еще предстоит ответить.Увеличение люминальных протеаз, например, панкреатического и микробного происхождения, по-видимому, не является специфичным для этой модели, так как об этом уже сообщалось при ВЗК человека [15, 16]. Здесь мы обнаружили доказательства явной активизации или снижения элиминации протеаз до появления явных клинических признаков заболевания, таких как выраженная диарея. Известно, что протеазы, включая трипсин и триптазу, активируют PAR2, который распределяется по желудочно-кишечному тракту [24, 26]. Было показано, что у мышей введение агонистов PAR2 в толстую кишку повышает экспрессию PAR2 и вызывает воспаление [25]. Кроме того, в модели с нокаутом PAR2 химически индуцированный колит (например, с использованием декстрансульфата натрия) приводит к значительному снижению фенотипа [31]. Также было показано, что антагонист PAR2 является эффективным средством лечения колита на крысиных моделях ВЗК [32]. То, как эти результаты коррелируют с патогенными событиями ВЗК человека, требует дальнейшего изучения, но увеличение экспрессии кишечного PAR2 было показано в тканях как у пациентов с болезнью Крона, так и у пациентов с ЯК [33, 34]. Регуляция этого пути, по-видимому, является общей чертой моделей ВЗК грызунов с совершенно разным фоном, и здесь мы обнаружили, что он регулируется при колите, вызванном делецией Galphai2 .

В заключение, мы определили возможный новый фекальный маркер колита; пептидаза D. Дальнейшие исследования ее потенциала в качестве биомаркера ВЗК у людей имеют важное значение. Мы также определили возможный патогенный механизм нокаута Galphai2 , то есть увеличение фекальных протеаз и активацию уровней PAR2. Ранее сообщалось о важности PAR2 в других мышиных моделях, а также у пациентов с ВЗК. Однако, если эти изменения вызваны нокаутом Galphai2 per se или другими вторичными эффектами, требуется дальнейшее исследование.

Благодарности

Мы благодарим исследовательскую стипендию Бенгта Ире за научную поддержку, а также Центр протеомики Сальгренской академии Гетеборгского университета, который выполнил количественную масс-спектрометрию.

Вклад авторов

1. Концептуализация: БД.
2. Обработка данных: БД.
3. Формальный анализ: БД РК.
4. Приобретение финансирования: ДБ.
5. Исследование: БД МС.
6. Ресурсы: БД MS.
7. Надзор: EHH JH.
8. Проверка: БД.
9. Визуализация: БД РК ЭХХ.
10. Письмо – исходный вариант: DB EHH.
11. Написание – рецензирование и редактирование: БД МС РК JH EHH.

Каталожные номера

1. 1. Дигнасс А., Элиаким Р., Магро Ф., Маасер С., Чауэрс Ю., Гебоес К. и др. Второй европейский доказательный консенсус по диагностике и лечению язвенного колита, часть 1: определения и диагностика.Журнал Крона и колит. 2012;6(10):965–90.
2. 2. Mooiweer E, Severs M, Schipper ME, Fidder HH, Siersema PD, Laheij RJ, et al. Низкий уровень фекального кальпротектина предсказывает устойчивую клиническую ремиссию у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника: призыв к глубокой ремиссии. Журнал Крона и колит. 2015;9(1):50–5. Эпублик 18.12.2014.
3. 3. Райт Э.К., Камм М.А., Де Круз П., Гамильтон А.Л., Ричи К.Дж., Крежани Э.О. и др. Измерение фекального кальпротектина улучшает мониторинг и выявление рецидива болезни Крона после операции.Гастроэнтерология. 2015;148(5):938–47 e1. пмид:25620670
4. 4. Лихтман Дж. С., Маркобал А., Зонненбург Дж. Л., Элиас Дж. Э. Протеомика стула, ориентированная на хозяина: новая стратегия, ориентированная на реакцию кишечника на микробиоту кишечника. Молекулярная и клеточная протеомика MCP. 2013;12(11):3310–8. Центральный PMCID в PubMed: PMC3820941.
5. 5. Verberkmoes NC, Russell AL, Shah M, Godzik A, Rosenquist M, Halfvarson J, et al. Метапротеомика дробовика микробиоты дистального отдела кишечника человека.Журнал ISME. 2009;3(2):179–89. Эпублик 31.10.2008. пмид:18971961
6. 6. Рудольф У., Финеголд М.Дж., Рич С.С., Гарриман Г.Р., Шринивасан И., Брабет П. и др. Язвенный колит и аденокарцинома толстой кишки у мышей с дефицитом G альфа i2. Генетика природы. 1995;10(2):143–50. пмид:7663509
7. 7. Hornquist CE, Lu X, Rogers-Fani PM, Rudolph U, Shappell S, Birnbaumer L, et al. У мышей с дефицитом G(альфа)i2 с колитом наблюдается локальное увеличение CD4+ Т-клеток памяти и провоспалительных цитокинов Th2-типа. Журнал иммунологии (Балтимор, штат Мэриленд, 1950 г.). 1997;158(3):1068–77.
8. 8. Ohman L, Franzen L, Rudolph U, Harriman GR, Hultgren Hornquist E. Иммунная активация в слизистой оболочке кишечника перед началом колита у мышей с дефицитом Galphai2. Скандинавский журнал иммунологии. 2000;52(1):80–90. пмид:10886787
9. 9. Uhlig HH, Hultgren Hornquist E, Ohman Bache L, Rudolph U, Birnbaumer L, Mothes T. Реакция антител на диетические и аутоантигены у мышей с дефицитом G альфа i2.Европейский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. 2001;13(12):1421–9.
10. 10. Бьюрстен М., Виллен Р., Халтгрен Хорнквист Э. Передача колита Т-лимфоцитами с дефицитом Galphai2: влияние субпопуляций и тканевого происхождения. Воспалительные заболевания кишечника. 2005;11(11):997–1005. пмид:16239846
11. 11. Rangel I, Ganda Mall JP, Willen R, Sjoberg F, Hultgren-Hornquist E. Степень колита коррелирует с микробным составом и реакцией цитокинов в толстой и слепой кишке у мышей с дефицитом Galphai2. FEMS микробиология экология. 2016;92(7).
12. 12. Gotlind YY, Fritsch Fredin M, Kumawat AK, Strid H, Willen R, Rangel I, et al. Взаимодействие между путями эффекторных Т-клеток T(h)1 и T(h)17 в патогенезе спонтанного колита и рака толстой кишки у мышей с дефицитом Galphai2. Международная иммунология. 2013;25(1):35–44. пмид:22962436
13. 13. Анг К.С., Ротакер Дж., Пациурас Х., Берджесс А.В., Найс ЕС. Фекальная протеомика мышей: модельная система для обнаружения потенциальных биомаркеров колоректального рака.Журнал хроматографии А. 2010;1217(19):3330–40. пмид:19875126
14. 14. Олексевич М.Б., Кьельдал Х.О., Клено Т.Г. Идентификация белков стула у мышей C57BL/6J с помощью двумерного гель-электрофореза и масс-спектрометрии MALDI-TOF. Биомаркеры биохимические индикаторы воздействия, реакции и восприимчивости к химическим веществам. 2005;10(1):29–40. пмид:16097391
15. 15. Боэ М. Панкреатические и гранулоцитарные эндопротеазы в фекальных экстрактах пациентов с активным язвенным колитом. Скандинавский журнал гастроэнтерологии. 1987;22(1):59–64. Эпб 1987/01/01. пмид:3551049
16. 16. Эриксон А.Р., Кантарел Б.Л., Ламенделла Р., Дарзи Ю., Монгодин Э.Ф., Пан С. и соавт. Интегрированная метагеномика/метапротеомика выявляет признаки болезни Крона в микробиоте человека-хозяина. ПлоС один. 2012;7(11):e49138. Центральный PMCID в PubMed: PMC3509130. пмид:23209564
17. 17. Бергемальм Д., Форсберг К., Сривастава В., Граффмо К.С., Андерсен П.М., Браннстрем Т. и др. Супероксиддисмутаза-1 и другие белки во включениях трансгенных мышей с моделью бокового амиотрофического склероза.Журнал нейрохимии. 2010;114(2):408–18. пмид:20412382
18. 18. Вишневски Дж. Р., Зоугман А., Нагарадж Н., Манн М. Универсальный метод подготовки образцов для анализа протеома. Природные методы. 2009;6(5):359–62. Эпб 2009/04/21. пмид:19377485
19. 19. ЦИАГЕН. Функциональные анализы были проведены с использованием QIAGEN’s Ingenuity Pathway Analysis (IPA®, QIAGEN Redwood City) 2015. Доступно по адресу: http://www.qiagen.com/ingenuity).
20. 20. Юнипрот С.UniProt: центр информации о белках. Исследование нуклеиновых кислот. 2015; 43 (выпуск базы данных): D204–12. Центральный PMCID в PubMed: PMC4384041. пмид:25348405
21. 21. Улен М., Фагерберг Л., Халльстром Б.М., Линдског С., Оксволд П., Мардиноглу А. и соавт. Протеомика. Тканевая карта протеома человека. Наука. 2015;347(6220):1260419. пмид:25613900
22. 22. Gotlind YY, Raghavan S, Bland PW, Hornquist EH. Регуляторные Т-клетки CD4+FoxP3+ от мышей Galphai2-/- функционально активны in vitro, но не предотвращают колит.ПлоС один. 2011;6(9):e25073. Центральный PMCID в PubMed: PMC3178583. пмид:21966415
23. 23. Кэрролл И.М., Махаршак Н. Энтеробактериальные протеазы при воспалительных заболеваниях кишечника — патофизиология и клинические последствия. Всемирный журнал гастроэнтерологии. 2013;19(43):7531–43. Центральный PMCID в PubMed: PMC3837251. пмид:24431894
24. 24. Vergnolle N. Клиническая значимость рецепторов, активированных протеиназой (pars) в кишечнике. Кишка. 2005;54(6):867–74. Центральный PMCID в PubMed: PMC1774539.пмид:15888798
25. 25. Cenac N, Coelho AM, Nguyen C, Compton S, Andrade-Gordon P, MacNaughton WK, et al. Индукция воспаления кишечника у мышей путем активации рецептора-2, активируемого протеиназой. Американский журнал патологии. 2002; 161 (5): 1903–15. Центральный PMCID в PubMed: PMC1850779. пмид:12414536
26. 26. Soreide K. Рецептор 2, активируемый протеиназой (PAR-2), в патофизиологии желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы, воспалении и новообразованиях. Скандинавский журнал гастроэнтерологии.2008;43(8):902–9. пмид:1

    62

27. 27. Кавабата А., Курода Р., Нисида М., Нагата Н., Сакагучи Ю., Кавао Н. и др. Активируемый протеазой рецептор-2 (PAR-2) в поджелудочной и околоушной железах: иммунолокализация и участие оксида азота в вызванной секреции амилазы. Науки о жизни. 2002;71(20):2435–46. пмид:12231404
28. 28. Джексон С.Х., Деннис А.В., Гринберг М. Иминодипептидурия: генетический дефект в переработке коллагена; метод определения пролидазы в эритроцитах.Журнал Канадской медицинской ассоциации. 1975;113(8):759, 62–3. Центральный PMCID в PubMed: PMC1956611. пмид:803128
29. 29. Карна Э., Шока Л., Палка Дж. Тромбин-зависимая модуляция бета1-интегрин-опосредованной передачи сигналов активирует пролидазу и HIF-1альфа через p-FAK в клетках колоректального рака. Молекулярная и клеточная биохимия. 2012;361(1–2):235–41. пмид:21993963
30. 30. Палка Дж. А., Пханг Дж. М. Активность пролидазы в фибробластах регулируется взаимодействием внеклеточного матрикса с интегриновыми рецепторами клеточной поверхности.Журнал клеточной биохимии. 1997;67(2):166–75. пмид:9328822
31. 31. Hyun E, Andrade-Gordon P, Steinhoff M, Vergnolle N. Активация рецептора-2, активируемая протеазой: основной фактор воспаления кишечника. Кишка. 2008;57(9):1222–9. пмид:18460552
32. 32. Ломан Р.Дж., Коттерелл А.Дж., Суен Дж., Лю Л., До А.Т., Веси Д.А. и соавт. Антагонизм к активируемому протеазой рецептору 2 защищает от экспериментального колита. Журнал фармакологии и экспериментальной терапии.2012;340(2):256–65. пмид:22028393
33. 33. Christerson U, Keita AV, Soderholm JD, Gustafson-Svard C. Повышенная экспрессия рецептора-2, активируемого протеазой, в тучных клетках слизистой оболочки при илеите Крона. Журнал Крона и колит. 2009;3(2):100–8.
34. 34. Kim JA, Choi SC, Yun KJ, Kim DK, Han MK, Seo GS и др. Экспрессия активируемого протеазой рецептора 2 при язвенном колите. Воспалительные заболевания кишечника. 2003;9(4):224–9. пмид:12⁵

Текущее состояние фекального кальпротектина как диагностического или мониторингового биомаркера аллергии к белкам коровьего молока у детей: предварительный обзор

Непереносимость соевого белка Клиническая картина: анамнез, физикальное исследование, причины

Автор

Стефано Гуандалини, доктор медицины  Основатель и медицинский директор Центра целиакии, заведующий отделением детской гастроэнтерологии, гепатологии и питания отделения педиатрии Медицинского центра Чикагского университета; Профессор кафедры педиатрии, секция гастроэнтерологии, гепатологии и питания, Чикагский университет, отделение биологических наук, Притцкеровская школа медицины

Стефано Гуандалини, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Американская гастроэнтерологическая ассоциация, Европейское общество Детская гастроэнтерология, гепатология и питание, Североамериканское общество детской гастроэнтерологии, гепатологии и питания, Североамериканское общество по изучению глютеновой болезни

Раскрытие информации: Не раскрывать.

Соавтор (ы)

Агостино Ночерино, доктор медицины, доктор медицинских наук  Заведующий отделением детской онкологии, отделение педиатрии, Университет Удине, Италия

Агостино Ночерино, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Итальянское общество детской гематологии и онкологии, Итальянское общество педиатрии

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Редакционная коллегия специалистов

Мэри Л. Виндл, PharmD адъюнкт-профессор Фармацевтического колледжа Медицинского центра Университета Небраски; Главный редактор Medscape Drug Reference

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Дэвид А. Пикколи, доктор медицины , заведующий отделением детской гастроэнтерологии, гепатологии и питания Детской больницы Филадельфии; Профессор Медицинской школы Пенсильванского университета

Дэвид А. Пикколи, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Американская ассоциация по изучению заболеваний печени, Американская гастроэнтерологическая ассоциация, Североамериканское общество детской гастроэнтерологии, гепатологии и питания

Раскрытие информации : Нечего раскрывать.

Главный редактор

Кармен Каффари, доктор медицины  Доцент кафедры педиатрии, отделение гастроэнтерологии/питания, Медицинский факультет Университета Джона Хопкинса

Кармен Куффари, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Американский колледж гастроэнтерологии, Американская гастроэнтерологическая ассоциация, Североамериканское общество детской гастроэнтерологии, гепатологии и питания, Королевский колледж врачей и хирургов Канады

Раскрытие информации: Получил гонорары от Prometheus Laboratories за выступления и преподавание; Получал гонорары от Abbott Nutritionals за выступления и преподавание. для: Abbott Nutritional, Abbvie, бюро докладчиков.

Дополнительные участники

Хорхе Х. Варгас, доктор медицины , профессор педиатрии и клинический профессор детской гастроэнтерологии, Калифорнийский университет, Лос-Анджелес, Медицинская школа Дэвида Геффена; Врач-консультант кафедры педиатрии Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе Health System

Jorge H Vargas, MD, является членом следующих медицинских обществ: American Liver Foundation, Латиноамериканское общество детской гастроэнтерологии, гепатологии и питания, Американское общество желудочно-кишечных заболеваний Эндоскопия, Американское общество парентерального и энтерального питания, Североамериканское общество детской гастроэнтерологии, гепатологии и питания

Раскрытие информации: Не раскрывать.

Как пищевая аллергия влияет на пищеварение?

Everyday Health: Показатели пищевой аллергии продолжают расти. Каковы наиболее распространенные пищевые аллергии и как они влияют на пищеварение?

Mark Babyatsky, MD (mssm.edu)

Пищевая аллергия, по оценкам, затрагивает от 6 до 8 процентов детей в Соединенных Штатах и ​​от 3 до 4 процентов взрослых. Многие дети с аллергией на молочный белок перерастают ее. У взрослых чаще всего встречаются моллюски, арахис, лесные орехи, рыба и яйца.Следует отметить, что люди с аллергией на арахис и лесные орехи вряд ли перерастут ее, включая в последнее время все более распространенную аллергию на кунжут. Симптомы обычно острые, но могут быть хроническими и включать весь спектр аллергических реакций во всем организме. В пищеварительном тракте симптомы включают тошноту, рвоту, боль в животе, одинофагию (болезненное глотание), диарею или любую комбинацию этих симптомов.

Kenneth Brown, MD (kennethbrownmd.com)

Многие пациенты считают, что у них аллергия на какой-либо пищевой продукт, потому что у них была какая-то реакция после еды. Хотя неблагоприятные пищевые реакции распространены, истинная пищевая аллергия присутствует только у 3-4% взрослых. Аллергия определяется наличием неблагоприятного иммунного ответа на пищевой белок. Одной из наиболее распространенных пищевых аллергий является непереносимость глютена, известная как глютеновая болезнь. Целиакия является распространенной проблемой, затрагивающей 1 из каждых 133 человек в Соединенных Штатах. Это пожизненное аутоиммунное заболевание, при котором организм создает токсическую реакцию на прием любого типа глютена. Глютен — это белок, содержащийся во всех видах пшеницы, ячменя, ржи и некоторых видах овса.Это вызывает повреждение тонкой кишки, что не позволяет организму всасывать необходимые питательные вещества и минералы. Таким образом, целиакия классифицируется как заболевание аутоиммунной реакции на глютен.

Чаще всего люди имеют непереносимость пищевых продуктов, а не аллергию. Примером пищевой непереносимости является вздутие живота и диарея после употребления лактозы. У этих людей низкий уровень фермента лактазы, который препятствует расщеплению лактозы.

Лиза Ганджу, DO (wehealnewyork.org)

Некоторыми из наиболее распространенных пищевых аллергий являются арахис, молоко, соя, моллюски, рыба, орехи и яйца. Некоторые люди могут иметь очень серьезные реакции на эти продукты, если у них аллергия. Пищеварительный тракт является первой линией контакта с пищей, поэтому именно здесь возникают аллергические реакции. Желудочно-кишечная реакция заключается в быстром избавлении или нейтрализации раздражителя или аллергена. Общие желудочно-кишечные реакции включают боль в животе, тошноту, рвоту и диарею.

Лиза Пични, доктор медицинских наук (стопколонрак сейчас.com)

Восемь наиболее распространенных пищевых аллергенов — это молоко, пшеница, соя, моллюски, рыба, арахис, орехи и яйца. Целиакия связана с аллергией или чувствительностью к глютену, который содержится в пшенице. Пациенты с глютеновой болезнью могут мальабсорбировать макронутриенты и заболеть.

Seth Rosen, MD (gastrohealth.com)

Хотя истинную пищевую аллергию часто бывает трудно определить, существует множество состояний, которые могут вызывать непереносимость определенных продуктов.Примерами этого являются непереносимость лактозы и целиакия. Непереносимость лактозы — это неспособность правильно переваривать молоко и другие лактозные продукты, такие как сыр и мороженое. Пациент с непереносимостью лактозы может испытывать вздутие живота, газы и метеоризм, а также диарею после употребления этих продуктов. Существует специальный дыхательный тест, который можно использовать для диагностики этого состояния. Непереносимость лактозы довольно легко лечится ферментными таблетками (Lactaid) или молочными продуктами, в которые добавлен этот фермент. Даже сыр и мороженое можно найти с включенным ферментом.Существует также несколько альтернатив безлактозным молочным продуктам, например, соевое молоко или рисовое молоко. Целиакия, также называемая чувствительностью к глютену, возникает, когда организм развивает ненормальную реакцию на белок глютен, который обычно содержится в зернах. Этот иммунный ответ запускает реакцию в слизистой оболочке тонкой кишки, которая может вызвать мальабсорбцию. Лечение глютеновой спру заключается в отказе от продуктов, приготовленных из ячменя, ржи, овса или пшеницы. Есть специальный хлеб, печенье, пирожные и хлопья без глютена.Растущая частота диагностирования целиакии также привлекла внимание ресторанов, так что безглютеновые блюда обычно можно найти в меню. Вздутие живота, рецидивирующая или хроническая диарея, анемия, потеря веса и остеопороз — вот некоторые признаки и симптомы, развивающиеся в результате аллергии на глютен. Если вы испытываете некоторые из этих симптомов, сообщите об этом своему врачу.

Sutha Sachar, MD (susacharmd.com)

Пищевая аллергия возникает, когда ваша иммунная система идентифицирует определенный продукт как чужеродный или вредный.Ваша иммунная система заставляет клетки высвобождать антитела, известные как иммуноглобулин Е (IgE). Это то, что вызывает выброс гистамина, который вызывает боль в животе, диарею, тошноту или рвоту. Наиболее распространенные аллергии включают моллюсков, таких как креветки, омары и крабы; арахис; лесные орехи, такие как грецкие орехи и орехи пекан; рыбы; и яйца.

Albert Snow, ND (holisticgastroenterology.com)

Пищевая аллергия не влияет на пищеварение; пищеварение влияет на пищевую аллергию. Пищевая аллергия — это просто нарушение пищеварения.Еда никогда не виновата; это связано только с тем, что мы не обрабатываем его должным образом. Нам нужно перестать играть в «игру с обвинением». Наша пищеварительная система и наша иммунная система — это одно и то же. Ему все равно и нет разницы между пищей и зародышем. При хорошей работе переваривает и то, и другое. Молочные продукты и продукты из пшеницы вызывают большинство пищевых аллергий, потому что они более сложные. Пищеварение нашего организма было «притуплено» универсальным использованием определенных лекарств.

АА Старполи, Мэриленд (старполи.com)

Аллергия на глютен, известная как спру целиакии, вызывает острую воспалительную реакцию на уровне тонкой кишки ближе к желудку, что приводит к отеку и воспалению проксимальных отделов тонкой кишки, что препятствует правильному всасыванию питательных веществ . Существует также аллергия на сою, которая вызывает аналогичную воспалительную реакцию, препятствующую правильному усвоению. Непереносимость лактозы также может считаться одной из них.

Уильям Чей, MD (med.umich.edu)

Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID), входящий в состав Национального института здоровья, определяет пищевую аллергию как «неблагоприятное воздействие на здоровье, возникающее в результате специфического иммунного ответа, который воспроизводимо возникает при воздействии данной пищи. » Пищевой аллерген определяется как определенные компоненты пищи или ингредиенты в пище (обычно белки), которые распознаются определенными иммунными клетками и вызывают специфические иммунные реакции, приводящие к характерным симптомам.Пищевая аллергия может вызвать широкий спектр проблем, начиная от легких нечетких симптомов, таких как ощущение зуда во рту или горле, до серьезных последствий для дыхательной и сердечно-сосудистой систем, которые редко могут привести к смерти. Наиболее распространенными пищевыми аллергиями являются арахис, лесные орехи, рыба, моллюски, молоко и яйца. Хотя частота пищевых аллергий, по-видимому, растет, они все еще редки: от 4 до 8 процентов детей и 1-4 процента взрослых будут иметь настоящую пищевую аллергию. Большинство симптомов, возникающих после приема пищи, не являются результатом истинной пищевой аллергии.Так называемая пищевая непереносимость относится к развитию побочных реакций на пищу. Пищевая непереносимость довольно распространена, о ней сообщают от 5 до 45 процентов населения в целом.

Jacqueline Wolf, MD (drjacquelinewolf.com)

Пищевая аллергия встречается у 3-4% взрослых. У детей в возрасте до 5 лет пищевая аллергия примерно в два раза выше, чем у взрослых. IgE-опосредованная пищевая аллергия может вызвать анафилаксию (затрудненное дыхание, отек горла и кожи и т. д.). Арахис, лесные орехи, рыба и моллюски вызывают больше анафилактических реакций, чем другие продукты.Молоко у детей также является частой причиной пищевой аллергии. В этом состоянии может быть отек слизистой оболочки кишечника и даже поражения, такие как крапивница в кишечнике. Высвобождающийся гистамин может вызывать тошноту и/или диарею.

Целиакия может рассматриваться как иммунно-опосредованная аллергия, не связанная с IgE. Реакция на белок глиаден в глютене (белок пшеницы, ячменя и ржи) вызывает повреждение тонкой кишки и может привести к нарушению всасывания питательных веществ, диарее, анемии и даже боли в суставах и депрессии.В Соединенных Штатах от 1 из 80 до 1 из 140 человек страдают глютеновой болезнью, и это число растет. Это вызывает повреждение клеток слизистой оболочки тонкой кишки, так что питательные вещества не могут нормально всасываться, и даже может быть секреция жидкости в кишечнике.

Ректальные кровотечения у детей раннего возраста: клиническое, аллергологическое и микробиологическое обследование | Педиатрия

ЦЕЛЬ. Ректальное кровотечение является тревожным симптомом и требует дополнительного обследования.У младенцев это объясняется в основном гиперчувствительностью. Помимо пищевых антигенов, внутрипросветные микробные агенты воздействуют на незрелую слизистую оболочку кишечника. Хотя эти антигены контролируются в зрелом кишечнике, они могут вызывать воспаление в развивающемся желудочно-кишечном тракте. Целью этого исследования было проспективно оценить клиническое течение ректального кровотечения и оценить влияние аллергии на коровье молоко и аберрантной кишечной микробиоты на состояние. Поскольку изъятие антигенов коровьего молока из рациона младенцев используется в качестве первого лечения без доказательств его эффективности, мы также стремились оценить влияние диеты, исключающей коровье молоко, на продолжительность ректального кровотечения.

МЕТОДЫ. В исследование были включены 40 младенцев (средний возраст: 2,7 месяца) с видимым ректальным кровотечением в течение 2-летнего периода в отделении педиатрии университетской больницы Тампере. Большинство младенцев (68%) находились на полном грудном вскармливании. При включении младенцы были случайным образом распределены для получения диеты, исключающей коровье молоко ( n = 19), или для продолжения прежней диеты ( n = 21) в течение 1 месяца. Были оценены результаты колоноскопии, фекальной бактериальной культуры, флуоресцентной гибридизации in situ выбранных родов кишечника, специфического обнаружения фекальных энтеровирусов, ротавирусов и аденовирусов, электронной микроскопии кала на наличие вирусов и электронной микроскопии слизистых оболочек на наличие вирусов.Во время каждого визита оценивали степень тяжести атопической экземы, если таковая была, по методу SCORAD. При оценке степени сенсибилизации исследовали сывороточный общий иммуноглобулин Е (IgE) и специфический IgE, а также кожные прик-тесты на коровье молоко, яйца и пшеницу. Аллергию на коровье молоко диагностировали с помощью элиминационной и провокационной проб. Пятеро пациентов были госпитализированы; все остальные лечились амбулаторно. Последующие визиты были запланированы через 1 месяц и в возрасте 1 года. Шестьдесят четыре здоровых референтных младенца были отобраны в качестве контроля в соответствии со следующими критериями: возраст и сроки взятия образцов кала идентичны в пределах 1 месяца.

РЕЗУЛЬТАТЫ. В общей сложности у 32 (80%) младенцев во время наблюдения отмечался стул с примесью крови (средний [диапазон]: 2,1 [1–15] в день). Среднее количество дней с ректальным кровотечением при последующем наблюдении составило 6. Как правило, стул с примесью крови возникал нерегулярно, по этой причине среднее время до последнего ректального кровотечения составляло 24 (диапазон: 1–85) дней с момента поступления. Атопическая экзема при поступлении или во время наблюдения была диагностирована у 38% новорожденных. Повышение концентрации специфических IgE или положительный кожный прик-тест встречались редко.Рост детей был нормальным при поступлении и во время наблюдения. Колоноскопия выявила типично очаговую эритему слизистой оболочки и афтозные изъязвления. Слизистая оболочка выглядела нормальной менее чем у половины пациентов. Трещин аноректальной области и полипов толстой кишки не обнаружено. Световая микроскопия показала, что общая архитектура слизистой оболочки хорошо сохранилась. Наиболее частыми аномалиями были острое воспаление или поствоспалительное состояние и очаговая инфильтрация эозинофилами в собственной пластинке. Диета, исключающая коровье молоко, не влияла на продолжительность ректального кровотечения.Аллергия на коровье молоко диагностирована у 7 (18%) пациентов. Агрегаты вирусных частиц были обнаружены в слое микроворсинок эпителия толстой кишки в 8 случаях. Поверхностный эпителий вирус-позитивных биоптатов толстой кишки регулярно обнаруживал дегенеративные изменения в слое микроворсинок и эпителиальных клетках. Электронно-микроскопическое исследование биоптатов толстой кишки выявило вирусные частицы (диаметром 30 нм) на поверхности эпителиальных клеток. Вирусные частицы или РНК присутствовали в фекалиях лишь у меньшинства пациентов.Все фекальные культуры были отрицательными для Salmonella, Shigella и Yersinia . Campylobacter jejuni был обнаружен в кале 1 пациента, а культура фекалий была положительной на Clostridium difficile у 4 пациентов, Staphylococcus aureus у 8 пациентов и дрожжи у 2 пациентов. Флуоресцентная гибридизация in situ показала, что на момент поступления общее количество бактерий, а также количество бифидо- и лактобактерий в кале у больных было ниже по сравнению с контрольной группой.Концентрации микробов в кале, характерные для данного исследования ( Bacteroides , бифидобактерии, Clostridium , лактобациллы и энтерококки), существенно не отличались между временем поступления и вторым визитом у пациентов или контрольной группы. В возрасте 1 года 7 пациентов все еще страдали аллергией на коровье молоко, 5 из них также страдали множественной пищевой аллергией. Атопическая экзема и гистопатологически подтвержденное воспаление слизистой оболочки толстой кишки при поступлении были связаны с персистенцией аллергии на коровье молоко в возрасте 1 года.Ни у одного из пациентов не было желудочно-кишечных жалоб или видимой крови в стуле.

ВЫВОДЫ. Ректальное кровотечение у младенцев, как правило, является доброкачественным и самокупирующимся заболеванием. Кровавый стул происходил нерегулярно всего несколько дней в течение следующих месяцев. Как и в предыдущем отчете, большинство детей находились на исключительно грудном вскармливании. У большинства больных причина состояния остается неизвестной. У некоторых пациентов можно увидеть связь с вирусами. Микробы, которые обычно вызывают кровавую диарею у детей старшего возраста и взрослых, Salmonella , Shigella и Yersinia , в настоящем материале отсутствовали.Низкое количество бифидобактерий в образцах кала может указывать на значительное отклонение от нормы, которое может стать целью пробиотического вмешательства для нормализации микробиоты кишечника. Кишечная микробиота в целом казалась стабильной, поскольку количество основных групп тестируемой микробиоты существенно не менялось между моментом поступления и через 1 месяц.