И натрия хлорид: Натрия хлорид инструкция по применению: показания, противопоказания, побочное действие – описание Sodium chlorid р-р д/инф. 0.9%: бутыли 100 мл, 150 мл, 200 мл, 400 мл 1 шт. (5399)

Откуда берется поваренная соль? (Пожалуйста, не говорите супермаркет.) Галит, хлорид натрия, естественным образом встречается в огромных геологических отложениях солевых минералов, оставшихся от медленного испарения древней морской воды. (Вы удивлены? Вы когда-нибудь ощущали вкус морской воды во рту на пляже?) Эти месторождения добываются для получения различных солей, в том числе хлорида натрия, достаточного для наполнения многих, многих солонок!

Что в имени?

NaCl — химическое короткое
рука (или формула) для хлорида натрия. Это просто
, чтобы узнать, откуда берется «Cl» (хлор, да), но как же, спросите вы, «Na» представляет натрий?

Ответ: «На»
означает «натрий»,
Латинское слово , обозначающее натрий.

NaCl абсолютно необходим для жизни на Земле. Это необходимый ингредиент в рационе людей и животных. А хлорид натрия имеет буквально тысячи применений! Одно из таких применений — служить источником хлора для химического производства. Почему, спросите вы? И вот почему: хлор известен как «химическое вещество рабочей лошадки». Он играет ключевую роль в производстве тысяч товаров, от которых мы зависим каждый день, в том числе волейбольных мячей, компьютеров, автомобилей, химикатов для бассейнов, лекарств и косметики (см. Дерево продукта хлора). Это лишь небольшая часть многих предметов, которые производятся с использованием хлора.

Как вы думаете, как освободить хлор из этих плотно упакованных кристаллов NaCl? Электричество — это инструмент, используемый для электрохимического расщепления NaCl, высвобождая Cl для его многочисленных химических применений. Инженеры-химики проектируют системы, позволяющие создавать пузырьки газообразного хлора из соленой, электрифицированной воды.Газ улавливается и охлаждается настолько, что превращается в жидкость.

Весь процесс очень крутой (но небезопасно пытаться дома). Средний американец потребляет около 7 фунтов хлорида натрия в год и более 500 фунтов в течение жизни! Сложите это вместе с использованием всех продуктов, изготовленных с использованием хлора, и я думаю, вы согласитесь, что NaCl является важным соединением!

Пожалуйста, передайте галит!

Дополнительные вопросы:

1. Найдите натрий и хлор в Периодической таблице элементов.Каковы их атомные номера? Какую информацию мы можем получить из атомного номера элемента?


2. NaCl известен как ионное соединение. Что это обозначает?


3. Хлор известен как двухатомная молекула. Объясните, что это значит. (Подсказка: «ди» означает «два».)

Идеи научных проектов:

1. Галофиты — это растения, приспособившиеся к жизни в среде с высоким содержанием соли. Назовите некоторые из этих сред и опишите некоторые из найденных там галофитов.Как они приспособились к «соленому» существованию? Что происходит с обычными растениями, если их поливать соленой водой?


2. Узнайте химические соединения и названия минералов для некоторых других солей, которые образуются в результате медленного испарения древней морской воды (кроме хлорида натрия). Для чего они нужны?

Чтобы просмотреть список предыдущих функций «Хлорное соединение месяца», щелкните здесь.

Хлорид натрия — обзор

8.3 Галогениды

Хлорид натрия в огромных количествах встречается во всем мире и является одним из наиболее полезных неорганических химикатов природного происхождения. Он добывается в нескольких местах мира и встречается в соляных пластах, соляных рассолах, морской воде и других источниках. Многие важные соединения натрия производятся с хлоридом натрия в качестве исходного материала. Около 50% NaCl расходуется в процессах производства гидроксида натрия и хлора.Процесс, проиллюстрированный в формуле. (8.28) является источником большей части 19 миллиардов фунтов NaOH и 22 миллиардов фунтов хлора, производимых ежегодно.

(8,28) 2NaCl + 2h3O → электричество2NaOH + Cl2 + h3

Значительное количество также используется в процессе для получения натрия и хлора электролизом расплавленного NaCl.

(8,29) 2NaCl → электричество2Na + Cl2

Из-за высокой температуры плавления хлорида натрия (801 ° C) также проводится электролиз эвтектики с более низкой температурой плавления с CaCl ₂ .Большие количества NaCl используются в пищевой промышленности и для таяния снега и льда с шоссе и тротуаров. Для последнего CaCl ₂ более эффективен из-за того, что водная смесь, содержащая приблизительно 30% CaCl ₂ , плавится при -50 ° C, а самая низкоплавкая смесь NaCl и воды плавится при -18 ° C.

Исторически сложилось так, что процесс Solvay для получения карбоната натрия требовал большого количества NaCl для всей реакции

(8,30) NaCl ( водн. ) + CO ₂ ( г ) + H ₂ O ( л ) + NH ₃ ( водн. ) → NaHCO ₃ ( с ) + NH ₄ Cl ( водн. )

После отделения твердого NaHCO ₃ при нагревании образуется Na ₂ СО ₃ .

(8,31) 2 NaHCO ₃ → Na ₂ CO ₃ + H ₂ O + CO ₂

Процесс Solvay по-прежнему важен в глобальном масштабе, но в США Na ₂ CO ₃ получается из минерала трона , Na ₂ CO ₃ · NaHCO ₃ · 2 H ₂ O. Более 23 миллиардов фунтов Na ₂ CO ₃ производятся ежегодно из троны.

Галогениды бериллия — это кислоты Льюиса, которые образуют аддукты со многими типами доноров электронных пар (амины, простые эфиры, фосфины и т. Д.)) и легко образуют комплексные ионы. Например, ион BeF ₄ ^2- образуется в результате реакции

(8,32) BeF ₂ + 2 NaF → Na ₂ BeF ₄

В этих случаях, когда имеется четыре связи с бериллием, связь вокруг центрального атома приблизительно тетраэдрическая.

Ожидается, что в паровой фазе дигалогениды металлов группы IIA будут иметь линейную структуру. Однако валентные углы в CaF ₂ , SrF ₂ и BaF ₂ оцениваются примерно в 145 °, 120 ° и 108 ° соответственно.Хотя линейные структуры предсказываются на основе модели отталкивания пар электронов валентных оболочек (VSEPR), энергия, необходимая для изгиба этих молекул, достаточно мала, поэтому малозаметные факторы приводят к изогнутым структурам. Считается, что могут быть задействованы два фактора: участие внутренних орбиталей d и поляризация этих орбиталей. Хотя теория связывания в этих соединениях не будет описываться подробно, эти примеры служат, чтобы показать, что простых подходов к химическому связыванию не всегда достаточно для объяснения структуры некоторых относительно простых молекул.

В чем разница между натрием и солью?

Технически соль может быть любым ионным соединением, образованным реакцией кислоты и основания, но большую часть времени это слово используется для обозначения поваренной соли, то есть хлорида натрия или NaCl. Итак, вы знаете, что соль содержит натрий, но это не одно и то же.

Натрий

Натрий — химический элемент. Он очень реактивен, поэтому в природе не встречается в свободном виде. Фактически, он самовозгорается в воде, поэтому, хотя натрий необходим для питания человека, вы не захотите есть чистый натрий.Когда вы глотаете соль, ионы натрия и хлора в хлориде натрия отделяются друг от друга, делая натрий доступным для использования вашим организмом.

Натрий в организме

Натрий используется для передачи нервных импульсов и содержится в каждой клетке вашего тела. Баланс между натрием и другими ионами регулирует давление клеток и связан с вашим кровяным давлением.

Количество натрия в соли

Поскольку уровень натрия имеет решающее значение для многих химических реакций в организме, количество натрия, которое вы едите или пьете, имеет важные последствия для вашего здоровья.Если вы пытаетесь регулировать или ограничивать потребление натрия, вы должны понимать, что количество потребляемой соли связано с количеством натрия, но не одно и то же. Это связано с тем, что соль содержит как натрий, так и хлор, поэтому, когда соль диссоциирует на свои ионы, масса делится (не поровну) между ионами натрия и хлора.

Причина, по которой соль — это не только половина натрия и половина хлора, заключается в том, что ион натрия и ион хлора не имеют одинакового веса.

Расчет образца соли и натрия

Например, вот как рассчитать количество натрия в 3 граммах (г) соли.Вы заметите, что 3 грамма соли не содержат 3 грамма натрия, равно как и половина массы соли от натрия, поэтому 3 грамма соли не содержат 1,5 грамма натрия:

• Na: 22,99 г / моль
• Cl: 35,45 г / моль
• 1 моль NaCl = 23 + 35,5 г = 58,5 г на моль
• Натрий 23 / 58,5 x 100% = 39,3% соли натрия

Тогда количество натрия в 3 граммах соли = 39,3% х 3 = 1,179 г или примерно 1200 мг.

Самый простой способ вычислить количество натрия в соли — это вычислить 39.3% количества соли приходится на натрий. Просто умножьте массу соли на 0,393, и вы получите массу натрия.

Лучшие диетические источники натрия

Хотя поваренная соль является очевидным источником натрия, CDC сообщает, что 40% диетического натрия поступает из 10 продуктов. Список может показаться неожиданным, потому что многие из этих продуктов не имеют особого соленого вкуса:

• Хлеб
• Колбасные изделия (например, мясное ассорти, бекон)
• Пицца
• Птица
• Суп
• Бутерброды
• Сыр
• Паста (обычно приготовленная на подсоленной воде)
• Мясные блюда
• Закуски

Хлорид натрия является ионной контрольной точкой для человеческих Th3-клеток и формирует атопическое микроокружение кожи.

Игра с засаливанием Т-клеток

Хлорид натрия может стимулировать дифференцировку Т _H 17 в Т-лимфоцитах CD4.Маттиас и др. . теперь показывают, что хлорид натрия может также способствовать ответам T _H 2, которые являются центральными при аллергических заболеваниях. Они измерили влияние различных концентраций хлорида натрия на память и на наивные Т-клетки человека, а также клетки мыши. В совокупности высший хлорид натрия обеспечивал транскрипционную и фенотипическую программу T _H 2. Интересно, что пораженная кожа пациентов с атопическим дерматитом, но не пациентов с псориазом, имела повышенный уровень натрия. Эти данные свидетельствуют о том, что хлорид натрия может быть потенциальным участником прогрессирования кожной аллергии.

Реферат

Заболеваемость аллергическими заболеваниями увеличилась за последние 50 лет, вероятно, из-за факторов окружающей среды. Однако природа этих факторов и способ действия, с помощью которого они вызывают иммунное отклонение типа 2, характерное для атопических заболеваний, остаются неясными. Ранее сообщалось, что пищевой хлорид натрия способствует поляризации клеток Т-хелперов 17 (T _H 17) с последствиями для аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз.Здесь мы демонстрируем, что хлорид натрия также эффективно способствует клеточным ответам T _H 2 на нескольких регуляторных уровнях. Хлорид натрия увеличивал продукцию интерлейкина-4 (IL-4) и IL-13, подавляя продукцию интерферона-γ (IFN-γ) в Т-клетках памяти. Он изменял судьбы альтернативных Т-клеток в клеточный фенотип T _H 2, а также индуцировал поляризацию de novo T _H 2 клеток от наивных предшественников Т-клеток. Механически хлорид натрия проявлял свои эффекты через осмочувствительный фактор транскрипции NFAT5 и киназу SGK-1, которая регулировала сигнатурные цитокины T _H 2 и основные факторы транскрипции в гиперосмолярных солевых условиях.Кожа пациентов, страдающих атопическим дерматитом, содержала повышенное содержание натрия по сравнению с атопической кожей без поражения и здоровой кожей. Эти результаты предполагают, что хлорид натрия представляет собой до сих пор упускаемую из виду контрольную точку кожного микроокружения при атопическом дерматите, которая может вызывать реакции клеток T _H 2, организаторов атопических заболеваний.

ВВЕДЕНИЕ

Наивные Т-хелперные клетки (T _H ) могут дифференцироваться в функционально разнообразные подмножества эффекторных Т-клеток, которые адаптированы к специфическим антимикробным ответам.Они реагируют на поляризующие сигналы, такие как сила сигнала рецептора Т-клеток (TCR), костимуляция и передача сигналов цитокинов, чтобы дифференцироваться в отдельные подмножества Т-клеток ( 1 ). Тем не менее, многое остается неизвестным в отношении того, как сигналы распознаются и интегрируются для определения судьбы и функции клетки. Считается, что факторы микроокружения в тканях обеспечивают дополнительные сигналы, которые управляют дифференцировкой клеток T _H . Недавно было продемонстрировано, что ионные контрольные точки, такие как хлорид натрия (NaCl) и калий, модулируют ответы Т-клеток.В частности, было показано, что NaCl усиливает дифференцировку клеток Т _H 17 от наивных предшественников Т-клеток с последствиями для патогенеза рассеянного склероза в условиях диеты с высоким содержанием соли ( 2 — 4 ). Более того, было показано, что повышенные концентрации калия после некроза опухолевых клеток обеспечивают благоприятное для опухоли микроокружение, парализуя функции цитотоксических Т-клеток ( 5 ). Следовательно, ионный состав микроокружения представляет собой относительно неизученную детерминанту поляризации Т-клеток и эффекторных функций Т-клеток.

Эпидемиологические исследования убедительно подтверждают стремительный рост заболеваемости аллергическими и аутоиммунными заболеваниями за последние 50 лет. Считается, что это связано с негенетическими изменениями окружающей среды, происхождение которых пока неясно ( 6 ). Более 100 лет назад в известном педиатрическом справочнике на основании клинических наблюдений, но без каких-либо механистических доказательств, утверждалось, что при атопическом дерматите при ограничении употребления соли в рационе возможно улучшение. Принимая во внимание неуклонное увеличение диетического потребления обработанных пищевых продуктов и, следовательно, NaCl за последние 50 лет, мы решили изучить потенциальную связь между ионной передачей сигналов, опосредованной NaCl, и усиленными клеточными ответами T _H 2, которые являются виновниками патогенез аллергических заболеваний.Наши данные демонстрируют существование ионной детерминанты иммунитета T _H 2, которая ставит под сомнение текущую концепцию поляризации Т-клеток, ориентированную на цитокины, и предлагает альтернативную мишень для иммунитета типа 2 при аллергических заболеваниях.

РЕЗУЛЬТАТЫ

NaCl усиливает T

Недавние сообщения продемонстрировали сильное влияние NaCl на увеличение T _H 17 дифференцировку клеток от наивных предшественников Т-клеток в условиях поляризующих цитокинов ( 2 , 3 ).Однако NaCl особенно обогащен периферическими барьерными тканями, такими как кожа, в которые наивные Т-клетки не проникают во время их обычного пути рециркуляции ( 8 ). Поэтому мы стремились определить, может ли NaCl также регулировать ответы Т-клеток на уровне памяти и эффекторных Т-лимфоцитах, что поддерживало бы роль ионных сигналов для иммуномодуляции in situ.

Мы очистили CD4 ⁺ CD45RA ^— Т-клетки памяти из крови здоровых взрослых доноров и проанализировали экспрессию интерлейкина-17 (IL-17) на уровне отдельных клеток после размножения антителами CD3 и CD28 в отсутствие ( низкий уровень NaCl) или присутствие (высокий уровень NaCl) дополнительных 50 мМ NaCl, что отражает физиологические концентрации NaCl в периферической крови и коже соответственно ( 9 ).Добавление NaCl свыше 50 мМ снижает жизнеспособность клеток и приводит к их гибели (рис. S1). NaCl сильно усиливал экспрессию IL-17 в клетках памяти T _H в отсутствие экзогенных поляризующих цитокинов (рис. 1A). В соответствии с общим соблюдением сигнатуры клеток T _H 17, он также увеличивал IL-22, цитокин, участвующий в восстановлении барьерных тканей, а также другие связанные с клетками сигнатуры T _H 17, такие как master транскрипционный фактор ROR-γt, хемокиновый рецептор CCR6 и антимикробный цитокин T _H 17 IL-26 (рис.S2) ( 10 — 12 ). Т-клетки памяти демонстрируют сложный паттерн экспрессии цитокинов. Поэтому мы расширили наш анализ на другие цитокины, определяющие клеточный клон T _H . Неожиданно мы наблюдали повышающую регуляцию сигнатурного цитокина IL-4 T _H 2 как с помощью окрашивания внутриклеточных цитокинов, так и с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) даже в присутствии IL-4-нейтрализующих антител (рис. 1, A). и B, и фиг. S3 и S4). Сигнатура T _H 2 подтверждена повышающей регуляцией IL-13 (рис.1А). Экспрессия интерферона-γ (IFN-γ) подавлялась в соответствии с реципрокной регуляцией путей T _H 2 и T _H 1. Это смещение T _H 2 дополнительно поддерживалось повышающей регуляцией IL-4, IL-13 и IL-5 и понижающей регуляцией IFN-γ в клонах клеток T _H при рестимуляции в условиях высокого NaCl ( рис. S5). NaCl действует как одинаково эффективный сигнал для активации цитокинов T _H 2 и супрессии IFN-γ как экзогенный IL-4 (рис. 1C), который до сих пор считался основным T _H 2-поляризационным. коэффициент ( 13 ).NaCl также активировал экспрессию IL-4R в клетках памяти T _H , что поддерживает усиление обратной связи оси T _H 2 (рис. 1D). Экспрессия IL-12Rβ2 не изменилась. Эффект, стимулирующий T _H 2, был ограничен ионными осмолитами, содержащими натрий, и был самым сильным для NaCl среди всех протестированных сигналов тоничности. Искажение T _H 2 не могло быть вызвано неионными осмолитами, такими как мочевина или маннит, которые были протестированы при различных концентрациях (рис. S6, A и B).

( A до D ) Клетки памяти T _H были отсортированы из свежих мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) как CD4 ⁺ CD14 ^— CD45RA ^— Т-клетки с помощью проточной цитометрии и стимулированы для общий период культивирования 5 дней в присутствии (высокое) или отсутствие (низкое) дополнительных 50 мМ NaCl с анти-CD3 и анти-CD28 моноклональными антителами (mAb) в течение 48 часов.(A) Внутриклеточное окрашивание и проточная цитометрия [клеточный сортировщик, активируемый флуоресценцией (FACS)] на 5 день после рестимуляции форбола 12-миристата 13-ацетата (PMA) и иономицина. Показано окрашивание FACS отдельного эксперимента (слева) и совокупные данные, где каждый кружок представляет одного донора (IL-17, n = 18; IL-4, n = 17; IL-13, n = 11; IFN-γ, n = 22). (B) ELISA супернатантов клеточных культур, проанализированных на 5 день ( n = 3). (C) Проточная цитометрия и ELISA Т-клеток, стимулированных, как в (A) и (B), и обработанных в микросредах цитокинов IL-4 или IL-12 (панели FACS представляют три эксперимента; ELISA, n = 3). P = 0,007 (IL-4) и P = 0,003 (IFN-γ), критерий Краскела-Уоллиса. Апостериорный тест множественных сравнений Данна был проведен для сравнения между IL-4 и высоким содержанием NaCl. (D) Экспрессия IL-12RB, как показано FACS. Показаны один репрезентативный эксперимент и совокупные данные ( n = 5). ( E ) Кожные CD3 ⁺ Т-клетки, полученные после абдоминопластики, были отсортированы и охарактеризованы с помощью проточной цитометрии в соответствии с рис. S4 и стимулировали и анализировали, как в (A) ( n = 3).Парные тесты Стьюдента t использовались для сравнения между двумя группами. n.s., не имеет значения.

Мы также расширили наши исследования влияния сигналов NaCl на компартмент Т-лимфоцитов CD8. Уровень IL-17 повышается в Т-клетках памяти CD8 в условиях повышенного содержания NaCl, хотя и в гораздо меньшей степени, чем в Т-клетках памяти CD4. Однако продукция IL-4 не увеличивалась в Т-клетках CD8, в отличие от Т-лимфоцитов CD4 (рис. S7).

Затем мы проверили реакцию Т-клеток, выделенных из здоровой кожи человека, на рестимуляцию NaCl.Периферические ткани содержат гетерогенные популяции Т-клеток памяти, которые отличаются от таковых в крови ( 14 ). Их функциональная пластичность и реакция на иммуномодулирующие факторы остаются плохо определенными. Резидентные в коже Т-клетки особенно подвержены воздействию ионных сигналов, вызванных колебаниями концентрации NaCl, поскольку известно, что кожа действует как резервуар для избыточного пищевого NaCl ( 15 ). Чтобы охарактеризовать идентичность Т-клеток кожи, мы фенотипировали их в соответствии с их дифференциальной экспрессией CD69 и CD103, поскольку оба маркера коррелируют с местностью в ткани ( 16 ).Это подтвердило гетерогенный состав Т-клеток памяти кожи, который отличается от субпопуляций Т-клеток памяти в крови (рис. S8). Мы обнаружили устойчивую повышающую регуляцию IL-4 с сопутствующей понижающей регуляцией IFN-γ в резидентных коже Т-клетках при стимуляции NaCl (рис. 1E). Кроме того, мы также наблюдали повышающую регуляцию хемокинового рецептора CCR8 кожи под действием NaCl, что коррелирует с более высокой экспрессией IL-4 и более низкой экспрессией IFN-γ (рис. S9, A и B), а также с Т-клетками кожи. резидентура ( 17 , 18 ).Следовательно, NaCl также оказывает стимулирующее действие на Т _H 2 на субпопуляции Т-клеток памяти, которые находятся в местах с относительно повышенными концентрациями NaCl in vivo. В целом, эти данные демонстрируют, что ионные сигналы, оказываемые NaCl, могут напрямую изменять функции Т-клеток памяти человека в отсутствие сигналов экзогенных цитокинов с мощными функциями, способствующими развитию Т _H 2, которые могут соответствовать 2-поляризующему потенциалу T _H Ил-4.

NaCl индуцирует транскрипционную активацию программы T

Чтобы дополнительно подтвердить, что NaCl может способствовать идентичности T _H 2, мы проанализировали экспрессию основных факторов транскрипции после стимуляции Т-клеток в присутствии повышенных концентраций NaCl (Рисунок.2). GATA-3, главный фактор транскрипции клеток T _H 2, сильно повышается в Т-клетках памяти при стимуляции TCR в присутствии дополнительного NaCl, тогда как T-bet, главный фактор транскрипции T _H 1 клеток, подавлялась (фиг. 2А). Мы также создали клоны Т-клеток, чтобы избежать избирательного разрастания неопределенных субпопуляций Т-клеток, и подвергли каждый клон индивидуальной рестимуляции в присутствии или отсутствии дополнительного NaCl. GATA-3 сильно повышается в клонах Т-клеток памяти при стимуляции NaCl, тогда как T-bet снижается, что снова подтверждает роль NaCl в стимулировании T _H 2 (рис.2Б). В соответствии с более высокой экспрессией IL-17 (фиг. 1A и фиг. S5B), экспрессия ROR-γt также усиливалась при стимуляции NaCl (фиг. 2B).

( A ) Т-клетки памяти человека стимулировали анти-CD3 и анти-CD28 mAb в течение 48 часов из 5-дневного периода культивирования в присутствии (высокий уровень) или отсутствие (низкий уровень) дополнительных 50 мМ NaCl перед внутриклеточным окрашиванием. для факторов транскрипции на 5-е сутки.Показаны репрезентативные анализы проточной цитометрии (слева) и совокупные данные (справа), причем каждый кружок указывает на одного донора и эксперимент (GATA-3, n = 4; T-bet, n = 3). MFI, средняя интенсивность флуоресценции. ( B ) Клоны Т-клеток были получены из CD4 ⁺ CD45RA ^— Т-клеток памяти в течение 14-дневного периода культивирования с облученными аллогенными питающими клетками и фитогемагглютинином, и были повторно стимулированы и проанализированы, как в (А). Клоны Т-клеток выбирали случайным образом из растущих культур для экспериментов по рестимуляции.Каждый кружок представляет собой индивидуальный клон Т-клеток (GATA-3, n = 14; T-bet, n = 24; ROR-γt, n = 24). Парный тест Стьюдента t использовался для сравнения между двумя группами (A и B). ( C ) Т-клетки памяти стимулировали, как в (A) и (B), в условиях низкого или высокого NaCl или в присутствии рекомбинантных поляризующих цитокинов в условиях низкого NaCl в течение 5 дней перед рестимуляцией в течение 30 минут с помощью IL-4, ИЛ-12 и ИЛ-6. Фосфорилирование молекул STAT оценивали после внутриклеточного окрашивания и проточной цитометрии ( n = 3). P = 0,025 (p-STAT6), P = 0,004 (p-STAT4) и P = 0,01 (p-STAT3), критерий Краскала-Уоллиса.

Преобразователи сигналов и активаторы белков транскрипции (STAT) играют решающую роль в передаче сигналов цитокинов и в определении поляризации клеток T _H ( 19 ). По этой причине мы исследовали влияние NaCl на молекулы STAT, определяющие клоны (рис. 2C). Клетки памяти T _H стимулировали поликлонально анти-CD3 и анти-CD28 в присутствии или отсутствии дополнительного NaCl в течение 5 дней или поляризующими цитокинами IL-4, IL-12 или IL-6 и IL-1β.На 5 день Т-клетки были кратковременно рестимулированы IL-4, IL-12 или IL-6 в течение 30 минут для индукции фосфорилирования STAT6, STAT4 или STAT3 соответственно. Т-клетки, которые стимулировали в присутствии NaCl, демонстрировали более сильное фосфорилирование STAT6 при воздействии ИЛ-4, чем контрольные Т-клетки, культивированные в отсутствие экзогенного NaCl. Однако на фосфорилирование STAT4 стимуляция NaCl не влияла. STAT3 сильно активируется с помощью NaCl в клетках памяти T _H (рис. 2C). Вместе эти результаты доказывают, что NaCl способствует клеточной сигнатуре T _H 2 и T _H 17 также на уровне транскрипционных привратников STAT.

Чтобы обеспечить более глобальный взгляд на смещение поляризации клеток T _H , индуцированное NaCl, мы выполнили секвенирование мРНК следующего поколения для анализа изменений экспрессии генов клеток памяти T _H , стимулированных в присутствии низкого по сравнению с высоким NaCl. концентрации. Обогащенный набор генов дифференциально экспрессируемых генов с использованием T _H 1- и T _H 2-связанных наборов генов подтвердил сильное смещение T _H 2, индуцированное NaCl, также на уровне транскриптома (рис.S10).

NaCl искажает отдельные подмножества клеток T

Далее мы хотели определить, проявляют ли судьбы отдельных клеток T _H пластичность для принятия фенотипа T _H 2 при воздействии NaCl. Поэтому мы выделили полностью дифференцированные человеческие субпопуляции T _H 1, T _H 2 и T _H 17 ex vivo из периферической крови в соответствии с их дифференциальной экспрессией поверхностных маркеров хемокиновых рецепторов, которые, согласно нашей предыдущей работе, надежно идентифицирует соответствующие линии клеток T _H ( 11 , 20 ).После 5 дней стимуляции CD3 и CD28 mAb субпопуляции Т-клеток сохранили свои характерные характерные профили цитокинов, как и ожидалось. В присутствии дополнительного NaCl клетки T _H 2 дополнительно активировали IL-4, тогда как их продукция IFN-γ на низком уровне дополнительно снижалась, что способствовало их идентичности T _H 2. Клетки T _H 2 также активировали IL-17, хотя общая экспрессия IL-17 оставалась относительно низкой. Клетки T _H -1 не изменяли свою низкую продукцию IL-4 или IL-17 при рестимуляции NaCl, но существенно подавляли IFN-γ.Клетки T _H 17 также увеличивали продукцию IL-4, подавляя при этом IFN-γ и повышая уровень IL-17 (фиг. 3A). Чтобы подтвердить пластичность как основной процесс приобретения фенотипа T _H 2, мы создали клоны Т-клеток и подвергли отдельные клоны рестимуляции в присутствии дополнительного NaCl. Этот подход подтвердил, что гомогенные популяции клональных Т-клеток могут приобретать или увеличивать продукцию IL-4, в то же время экспрессируя сниженный IFN-γ и повышенный IL-17 на клональном уровне (рис.3Б). Мы также наблюдали, что IL-4-отрицательные клоны Т-клеток могут приобретать способность продуцировать IL-4 в ответ на рестимуляцию NaCl (рис. 3, B и C). Это приобретение de novo экспрессии цитокинов также применимо к отдельным IL-17-отрицательным клонам Т-клеток, которые повышают экспрессию IL-17 при рестимуляции NaCl (рис. 3C).

( A ) Поляризованные подмножества клеток памяти человека T _H были отсортированы ex vivo в соответствии с дифференциальной экспрессией поверхностных маркеров хемокиновых рецепторов и рестимулированы в присутствии (высокое) или отсутствие (низкое) дополнительных 50 мМ NaCl с CD3 и CD28 mAb в течение 48 часов из 5-дневного периода культивирования.Экспрессию цитокинов определяли окрашиванием внутриклеточных цитокинов и проточной цитометрией. Парный тест Стьюдента t использовался для сравнения между двумя группами. ( B ) Случайные клоны Т-клеток, которые были созданы из Т-клеток памяти, стимулировали, как в (A), и их образец коэкспрессии цитокинов измеряли в присутствии низких и высоких концентраций NaCl. Каждый кружок представляет собой уникальный клон Т-клеток. ( C ) Отдельные клоны Т-клеток, которые были созданы из Т-клеток памяти, отбирали на основании их отрицательной экспрессии в отношении IL-4 или IL-17.Их рестимулировали в присутствии низких и высоких концентраций NaCl в течение 5 дней перед внутриклеточным окрашиванием. Показаны два индивидуальных клона из одного эксперимента и донора крови ( n = 3). ( D ) Напряжение внутриклеточных цитокинов CD4 человека ⁺ CD45RA ^— Т-клеток памяти после стимуляции, как в (А). Затем те же самые культуры Т-клеток разделяли и рестимулировали в течение еще 5 дней в условиях низкого и высокого NaCl перед окрашиванием внутриклеточных цитокинов и анализом проточной цитометрии после стимуляции PMA и иономицином на 10 день ( n = 4).Парный тест Стьюдента t использовался для сравнения между двумя группами. ( E ) Тепловая карта со средним метилированием CpG, измеренным путем глубокого секвенирования бисульфитных ампликонов ПЦР для указанных областей (p, промотор; I, интрон; e, экзон; числа в скобках указывают ампликоны для разных субрегионов соответствующих генов; от D1 до D3, доноры от 1 до 3; сравнение согласованных условий с низким и высоким содержанием NaCl для D1 – D3 с помощью теста Стьюдента t с скорректированными значениями P с коэффициентом ложного обнаружения).

Поскольку Т-клетки памяти являются долгоживущими и могут реактивироваться при изменении контекста микросреды их родственными антигенами, мы исследовали стабильность индуцированных NaCl функциональных изменений в клетках Т _H человека. С этой целью мы стимулировали клетки памяти T _H в условиях с высоким содержанием NaCl в течение 5 дней перед переводом их в условия с низким содержанием NaCl на следующие 5 дней рестимуляции анти-CD3 и анти-CD28 и наоборот. Данные демонстрируют, что повышающая регуляция IL-4 зависит от присутствия высоких концентраций NaCl, поскольку повышенная экспрессия IL-4 не может поддерживаться при рестимуляции в условиях низкого NaCl.Повторяющаяся рестимуляция нарушила общую продукцию IL-4. Этому частично противодействовали, если рестимуляция происходила в условиях с высоким содержанием NaCl (рис. 3D).

Ранее было показано, что эпигенетические механизмы регулируют стабильность и пластичность программ Т-клеток ( 21 ). Таким образом, мы определили, может ли ионная передача сигналов с помощью NaCl эпигенетически запечатлеть программу T _H 2 в человеческих клетках T _H . С этой целью мы проанализировали сигнатуры метилирования ДНК выбранных регуляторных областей в нескольких кандидатных локусах в ответ на NaCl, используя целевое сверхглубокое секвенирование ДНК, преобразованной бисульфитом.Наши данные предполагают, что увеличение эффекторных функций T _H 2 не вызывается изменениями метилирования в анализируемых областях (рис. 3E и таблица S1). Вместе, NaCl-опосредованная ионная передача сигналов, скорее всего, сохраняла гибкость эффекторных функций Т-клеток и обеспечивала острую адаптацию к микросреде в соответствии с функциональной реадаптацией к условиям с низким содержанием NaCl, показанной в экспериментах по рестимуляции (Рис. 3D).

NaCl способствует дифференцировке T

Учитывая T _H 2-промотирующие эффекты NaCl на память и субпопуляции эффекторных Т-клеток, мы затем попытались определить, он может оказывать прямые поляризующие эффекты на компартмент «наивных» Т-клеток.Хотя ранее было продемонстрировано, что NaCl способствует дифференцировке клеток Т _H 17 человека от наивных предшественников Т-клеток, это происходило только в присутствии экзогенных поляризующих цитокинов ( 2 ). Поэтому мы изолировали наивные Т-клетки человека до высокой степени чистоты и стимулировали их в присутствии или в отсутствие дополнительного NaCl. Мы наблюдали значительное увеличение продукции IL-4 и IL-13 при стимуляции NaCl в отсутствие поляризующих цитокинов (фиг. 4A). Это также происходило в присутствии нейтрализующих IL-4 антител (рис.S11). Как и ожидалось, IFN-γ может быть индуцирован поликлональной стимуляцией. Вместо этого он подавлялся в присутствии экзогенного NaCl в соответствии с реципрокным паттерном регуляции T _H 1-T _H 2. Кроме того, клетки, продуцирующие IL-17, могут незначительно, хотя и значительно, индуцироваться NaCl, даже в отсутствие экзогенных поляризующих цитокинов, тогда как поликлональная стимуляция сама по себе не оказывает стимулирующего действия на IL-17. Эти результаты были подтверждены количественной оценкой высвобождения цитокинов с помощью ELISA (рис.4Б). Подобно клеткам памяти, наивные клетки избирательно повышали экспрессию GATA-3, но не T-bet и ROR-γt, при стимуляции NaCl (фиг. 4C). В 17-поляризационных условиях T _H индуцированная NaCl повышающая регуляция IL-4 в наивных Т-клетках человека была отменена (фиг. S12).

( A ) Экспрессию цитокинов определяли с помощью проточной цитометрии после рестимуляции PMA и иономицином в течение 5 часов.Слева: экспрессия цитокинов у одного донора крови. Справа: совокупные данные всех доноров. ( B ) Супернатанты культур в (A) тестировали с помощью ELISA и нормализовали по количеству клеток путем подсчета шариков. ( C ) Экспрессию фактора транскрипции определяли с помощью проточной цитометрии после обработки, как в (A) и (B). Каждый кружок представляет отдельного донора крови. Парный тест Стьюдента t использовался для сравнения между двумя группами. gMFI, геометрический MFI.

Чтобы еще раз подтвердить роль гиперсолености в усилении иммунитета типа 2, мы проверили его влияние на поляризацию мышиных Т-клеток.Наивные Т-клетки, полученные из селезенки и лимфатических узлов мышей C57BL / 6, стимулировали mAb CD3 и CD28 в присутствии различных поляризующих цитокинов и цитокин-блокирующих антител, которые, как известно, надежно поляризуют T _H 1, T _H 2, T _H 17 и T _reg (регулятор T) in vitro. Наивное праймирование Т-клеток в присутствии дополнительных 40 мМ NaCl сильно усиливало праймирование клеток Т _H 2 рекомбинантным ИЛ-4 в отношении экспрессии ИЛ-4 и GATA-3.Присутствие дополнительного NaCl также индуцировало небольшую активацию IL-4 и GATA-3 в некоторых клеточных условиях, не связанных с T _H 2, несмотря на присутствие цитокинов, антагонистов IL-4, таких как IL-12 и трансформирующий фактор роста-β ( TGF-β) (рис. S13, от A до C). Повышенные концентрации IL-4 также были обнаружены в культуральном супернатанте клеток T _H 2, обработанных дополнительным NaCl (фиг. S13D).

Вместе эти находки демонстрируют, что NaCl действует как T _H 2 клеточно-поляризационный сигнал во время праймирования наивных Т-клеток как от людей, так и от мышей, что оценивается с помощью множественных считываний.Более того, это происходило в отсутствие экзогенных T _H 2-поляризующих цитокинов, таких как IL-4, а также независимо от аутокринной передачи сигналов IL-4 и, с клетками мыши, даже несмотря на присутствие T _H 2-противодействующих. цитокины.

SGK-1 и NFAT5 механически связывают передачу сигналов NaCl с программой T

Установив, что NaCl оказывает значительное влияние на индукцию и усиление клеточной программы T _H 2, мы попытались исследовать лежащую в основе молекулярную программу. механизмы.Мы проверили, индуцируется ли ядерный фактор активированных Т-клеток 5 (NFAT5), который, как известно, является осмочувствительным фактором транскрипции ( 22 ), в клетках памяти T _H человека при поликлональной активации в присутствии NaCl. Уровень NFAT5 был значительно повышен, что было оценено с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (qRT-PCR) (фиг. 5A). Киназа 1 (SGK-1), регулируемая сывороткой и глюкокортикоидами, также регулируется сигналами тоничности и является мишенью для NFAT5 ( 23 ).Соответственно, опосредованное короткой шпилькой РНК (shRNA) сайленсинг NFAT5 подавлял обилие транскрипта SGK1 в условиях низкого и высокого NaCl, тогда как молчание SGK1 не влияло на экспрессию NFAT5 (рис. S14). Подобно NFAT5, SGK-1 был более распространен в стимулированных CD3 и CD28 клетках памяти T _H в присутствии дополнительного NaCl (фиг. 5A). Мы обнаружили, что эти осмочувствительные молекулы непосредственно контролируют программу T _H 2 в гиперосмолярных условиях, поскольку индуцированное shRNA молчание NFAT5 и SGK-1 отменяет индуцированную NaCl повышающую регуляцию IL-4 и супрессию IFN-γ (рис.5Б). Это было дополнительно подтверждено экспрессией GATA-3 и T-bet, которая достигла базовой экспрессии после подавления NFAT5 и SGK-1 в гиперсалиновых условиях (фиг. 5C). shRNA, направленные против NFAT5 и SGK-1, не регулируют продукцию IL-4 или IFN-γ или экспрессию GATA3 или TBX21 в условиях низкого содержания NaCl (фиг. 5B и фиг. S15). Вместе эти данные демонстрируют роль факторов осмочувствительной транскрипции в регуляции программы T _H 2 в гиперосмотическом тканевом микроокружении.

( A ) qRT-PCR памяти T _H клеток. Парный тест Стьюдента t использовался для сравнения между двумя группами. A.U., условные единицы. ( B ) Продукция цитокинов в супернатантах определялась с помощью ELISA после стимуляции в условиях с низким или высоким содержанием соли в течение 5 дней и shRNA-опосредованного подавления SGK1 или NFAT5 ( n = от 3 до 6).Контрольные условия, обозначенные (-), содержат скремблированную кшРНК. Для IL-4 и IFN-γ: P ≤ 0,05 (анализ смешанных эффектов для множественных сравнений). Непарный тест Стьюдента t использовался для сравнения между двумя группами. ( C ) Внутриклеточное окрашивание и проточная цитометрия основного фактора транскрипции GATA-3 ( P ≤ 0,05, тест Краскела-Уоллиса) и T-bet ( P = 0,12, тест Краскела-Уоллиса) после стимуляции в условиях низкой — или условия с высоким содержанием соли в течение 5 дней и shRNA-опосредованное подавление NFAT5 и SGK1.Апостериорный тест Данна не был значимым (н.у.) для сравнения между условиями с низким содержанием NaCl со скремблированной шРНК и условиями с высоким содержанием NaCl с кшРНК для NFAT5 или SGK1. * P ≤ 0,05, апостериорный тест Данна для сравнения с условиями с низким содержанием NaCl, содержащими скремблированную кшРНК.

Атопический дерматит кожные поражения содержат повышенную концентрацию натрия

Наконец, мы стремились определить, связан ли NaCl с патогенезом аллергических заболеваний у людей. Несмотря на интенсивные и долгосрочные исследования, до сих пор остается неясным, как смещение T _H 2 возникает при аллергии ( 24 ).С этой целью мы исследовали концентрации NaCl в коже взрослых пациентов, страдающих атопическим дерматитом (также известным как атопическая экзема; таблица S2), хроническим воспалительным заболеванием кожи, вызванным T _H 2, с высокой распространенностью и сильно увеличивающейся частотой промышленно развитые страны ( 25 ). Нейтронно-активационный анализ (NAA) позволяет точно определять содержание элементов в органической матрице ( 26 ).

Пораженная кожа пациентов, страдающих атопическим дерматитом от умеренной до тяжелой степени (средний показатель атопического дерматита по шкале SCOR = 63), показывала сильно повышенные концентрации натрия по сравнению с подобранной кожей пациента без повреждений (в 30 раз) (рис.6A и таблица S2). Мы не наблюдали никакой разницы в содержании натрия в коже без повреждений у пациентов с атопическим дерматитом и в коже здоровых доноров того же возраста. Не было обнаружено обогащения натрия в воспаленной коже у пациентов того же возраста, страдающих псориазом средней и тяжелой степени (средняя площадь псориаза и индекс тяжести = 25), что указывает на то, что накопление NaCl не является общим феноменом воспаленной кожи (рис. 6B).

( A ) NAA 4-миллиметровой кожной биопсии. Пунш-биопсии были взяты из пораженной и не поврежденной кожи пациентов с атопическим дерматитом и здоровых людей (пациенты, перенесшие пластические операции) (таблица S2, информация для пациентов). Показана концентрация натрия (среднее ± стандартная ошибка среднего). Правая панель иллюстрирует клиническую картину типичного пациента с атопическим дерматитом. ( B ) NAA из пораженной и не поврежденной кожи пациентов с псориазом. Справа: клиническая картина типичного пациента с псориазом.( C ) Типичный спектр излучения гамма-квантов. Спектр был записан после облучения тепловыми нейтронами 4,3 × 10 ¹⁶ см ⁻² и времени счета 30 мин через 1 день после окончания воздействия. Непарный тест Стьюдента t использовался для сравнения между двумя группами.

ОБСУЖДЕНИЕ

Адаптивные иммунные клетки интегрируют сигналы из тканевого микроокружения, которые адаптируют их фенотип и функцию для антиген-специфической защиты хозяина и толерантности ( 27 ).ИЛ-4 до сих пор считался решающим цитокином для окончательной фиксации и поддержания иммунитета против T _H 2 ( 28 ). Мы демонстрируем здесь IL-4-независимый путь поляризации T _H 2, который опосредуется NaCl. NaCl был эффективен как во время фазы праймирования наивных Т-клеток, так и на стадии Т-клеток памяти, а также мог изменить судьбы альтернативных Т _H клеток на фенотип T _H 2. NaCl не только смещает дихотомию T _H 1-T _H 2 в сторону ответа T _H 2 клеток на множестве регуляторных уровней, но также способствует ответам эффекторных клеток T _H 17.Наши исследования идентифицировали NFAT5 и его нижележащую мишень SGK-1 как молекулярные регуляторы клеточной программы T _H 2 в гиперосмолярных условиях NaCl. Кожа пациентов с атопическим дерматитом, заболеванием, вызванным T _H 2, была сильно обогащена NaCl. Вместе эти результаты показали, что NaCl является ионной контрольной точкой для иммунитета 2 типа и связан с патогенезом атопического дерматита. Следовательно, нацеливание на передачу сигналов тоничности, индуцированной NaCl, может служить терапевтической стратегией для лечения аллергических заболеваний.

Предыдущие исследования продемонстрировали, что NaCl способствует дифференцировке клеток T _H 17 в условиях поляризующих цитокинов с последствиями для патогенеза рассеянного склероза ( 2 — 4 ). Наши данные подтверждают и расширяют эти выводы не только на уровне наивных, но и на уровне Т-клеток памяти, даже в отсутствие экзогенных поляризующих цитокинов. Хотя T _H 2-ассоциированные регуляторные факторы, такие как GATA-3 и T _H 2 эффекторных цитокинов, также оценивались в этих предыдущих исследованиях, это имело место в условиях 17-поляризующих цитокинов T _H , которые, согласно нашим исследованиям. исследования, аннулировали способность NaCl непосредственно продвигать клетки T _H 2 ( 2 ).Это говорит о том, что цитокиновое микроокружение модулирует влияние NaCl на дифференцировку и функцию Т-клеток.

Хотя наши данные согласуются с индуцированной NaCl поддержкой дифференцировки клеток T _H 17, они ставят под сомнение представление о патогенности клеток T _H 17, индуцированной NaCl, которая требует, чтобы IL-17 коэкспрессировался с IFN- γ на одноклеточном уровне ( 2 , 11 , 29 , 30 ). Подавление T _H 1 / IFN-γ, которое мы демонстрируем, согласуется не только с сопутствующей реципрокной повышающей регуляцией клеточных ответов T _H 2, но также с предыдущим наблюдением, что осмотическое сокращение Т-клеток под действием NaCl подавляет экспрессию IFN-γ ( 31 ).В целом, наши данные демонстрируют значительную пластичность функций Т-клеток в ответ на NaCl с общим перекосом в сторону судьбы T _H 2.

mTORC2 (мишень рапамицинового комплекса 2 у млекопитающих) действует как активатор выше по течению от SGK-1 ( 32 ). Наши результаты согласуются с предыдущими сообщениями, которые продемонстрировали роль mTORC2 в приверженности к линии T _H 2, но не идентифицировали, какие восходящие сигналы дифференциально задействованы в пути mTORC1 по сравнению с путем mTORC2 ( 33 , 34 ).Т-клеточная делеция mTORC2-специфического адаптера Rictor отменяет активацию SGK-1 ( 33 ), что приводит к снижению аллергической астмы, а также к усилению противоопухолевых и противовирусных иммунных ответов на моделях мышей. Кроме того, антагонист Wnt Dickkopf-1 стимулировал клеточные ответы T _H 2 через путь mTOR и SGK-1 в моделях на мышах астмы, индуцированной клещами домашней пыли, или инфекции Leishmania major ( 35 ). Было показано, что нижестоящими мишенями передачи сигналов SGK-1 после активации mTORC2 являются JunB и длинная изоформа фактора транскрипции TCF-1 для судьбы T _H 2 по сравнению с T _H 1, соответственно ( 32 ).Эти предыдущие сведения о контроле судьбы клеток T _H комплексами mTOR у мышей подтверждают наши выводы в контексте индуцированной гипертонической NaCl передачи сигналов Т-клеток. В частности, они предлагают NaCl в качестве вышестоящего регулятора mTORC2 и, следовательно, дифференцировки клеток T _H 2.

Мы обнаружили значительно повышенные концентрации натрия в пораженной коже пациентов с атопическим дерматитом (экзема) по сравнению с непораженной контрольной кожей, что соответствует патогенезу этого хронического воспалительного заболевания, опосредованному T _H 2 ( 36 ) .Предыдущие исследования профилей генов сообщили о повышении регуляции генов, кодирующих отрицательно заряженные гликозаминогликаны в пораженной атопической коже, что может способствовать и, таким образом, потенциально объяснять накопление ионов натрия в коже нековалентным связыванием ( 15 , 37 , 38 ). Гены, участвующие в отложении гликозаминогликанов (т.е. β1,3-глюкуронозилтрансфераза-I), являются нижестоящими мишенями для NFAT5 ( 39 ), который, как мы здесь сообщали, является транскрипционным регулятором ответа с высоким содержанием соли.

Глубокая дисфункция барьера при атопическом дерматите способствует микробному дисбиозу ( 40 — 42 ). Атопическая кожа сильно заселена Staphylococcus aureus , что значительно коррелирует с тяжестью атопического воспаления кожи, тогда как колонизация кожи другими бактериями значительно снижается при атопическом дерматите ( 42 , 43 ). S. aureus , как известно, толерантен к высоким концентрациям NaCl и перерастает другие бактерии в условиях повышенного содержания NaCl ( 42 , 44 , 45 ).Следовательно, накопление NaCl может служить объяснением микробного дисбактериоза атопического дерматита, который до сих пор остается загадкой.

Ограничением исследования является то, что наши исследования проводились с периферическими человеческими Т-клетками in vitro, и мы не установили твердо причинную связь отложения натрия в атопической коже и патогенеза заболевания, опосредованного T _H 2, in vivo. Недавно было показано, что эпителиальный сенсор натрия Na _x реагирует на нарушения гомеостаза натрия в коже, который характеризуется дефектом атопического барьера ( 46 ).Хотя в предыдущей работе не исследовалась прямая связь Na _x с иммунной системой, зондирование натрия было вовлечено в патогенез атопического дерматита, связанный с фибробластами, поскольку нокдаун in vivo Na _x у мышей приводил к улучшение атопического дерматита ( 46 ). Его нижележащая мишень ENaC, главный натриевой канал в эпителиальных клетках, регулируется NFAT5 и SGK-1 ( 46 — 48 ), которые мы идентифицировали здесь для регулирования смещения T _H 2.В совокупности эти данные, полученные на мышах и человеке, механически связывают свидетельства отложения натрия в атопической коже с его влиянием на патогенез атопического дерматита по оси T _H 2. Это могло, наконец, обеспечить механическое обоснование ранних наблюдательных клинических исследований и терапевтических рекомендаций Финкельштейна ( 7 ), который опубликовал в своем знаменитом педиатрическом справочнике в 1912 году, что ограничение соли в рационе улучшает атопический дерматит. Вместе можно представить себе редукционистскую модель патогенеза атопического дерматита, которая объединяет феномен отложения NaCl в атопической коже, индуцированное NaCl смещение атопического иммунного отклонения T _H 2 и гегемонию NaCl-резистентного С.aureus (рис. S16).

В заключение, наши исследования выявили NaCl как ионную контрольную точку для иммунитета человека 2 типа с потенциальной клинической значимостью при атопическом дерматите. Будущие исследования компартментализации и динамической регуляции NaCl и других осмолитов в различных тканях человека должны быть проведены, чтобы раскрыть весь репертуар иммуномодуляции, опосредованной тонусом, в здоровье и болезни.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Это экспериментальное исследование с участием крови человека от здоровых доноров или мышей C57BL / 6.Мы также собрали свежие образцы кожи от случайно выбранных здоровых доноров, перенесших плановую абдоминопластику или биопсию кожи пациентов с атопическим дерматитом и псориазом, а также соответствующую им кровь (таблица S2). Целью исследования было изучить влияние NaCl на функции Т-клеток с помощью функциональных анализов in vitro и установить связь с патогенезом кожных заболеваний, опосредованных Т-клетками, путем слепых измерений NaCl в образцах кожи с использованием ex vivo NAA. Репликация указана на рисунках и в подписях.Утверждение этических норм было получено от Институционального наблюдательного совета Технического университета Мюнхена (195 / 15s, 491/16 S и 146 / 17S) и Charité-Universitätsmedizin Berlin (EA1 / 221/11). Все работы проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией по экспериментам с участием человека. Первичные данные представлены в файле данных S1.

Очистка и сортировка клеток

PBMC выделяли центрифугированием в градиенте плотности с использованием Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). CD4 ⁺ Т-клетки выделяли из свежих PBMC путем положительной селекции с CD4-специфическими микрогранулами (Miltenyi Biotec) с использованием autoMACS Pro Separator.Подмножества клеток T _H были отсортированы до степени чистоты не менее 98% следующим образом: T _H 1 подмножество, CXCR3 ⁺ CCR4 ^— CCR6 ^— CD45RA ^— CD25 ^— CD14 ^— ; T _H 2 подмножества, CXCR3 ^— CCR4 ⁺ CCR6 ^— CD45RA ^— CD25 ^— CD14 ^— ; и T _H 17 подмножество, CXCR3 ^— CCR4 ⁺ CCR6 ⁺ CD45RA ^— CD25 ^— CD14 ^— .Память T _H клетки были выделены как CD3 ⁺ CD14 ^— CD4 ⁺ CD45RA ^— лимфоцитов, и наивные Т-клетки были выделены как CD3 ⁺ CD14 ^— CD4 ^{+ CD459 + CD45RA 90 CD45RO — CCR7 + лимфоцитов с чистотой более 98%. Антитела, используемые для сортировки с помощью проточной цитометрии, были идентичны антителам, которые мы описали ранее ( 11 , 30 ). Клетки сортировали с помощью BD FACSAria III (BD Biosciences).Т-клетки из свежей здоровой кожи человека (абдоминопластика) выделяли после 16-часового переваривания эпидермиса и дермы коллагеназой IV (0,8 мг / мл; Gibco).}

Культура клеток

Человеческие Т-клетки культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 2 мМ глутамина, 1% (об. / Об.) Заменимых аминокислот, 1% (об. / Об.) Пирувата натрия, пенициллина (50 Ед / мл), стрептомицин (50 мкг / мл; все от Invitrogen) и 10% (об. / об.) фетальная телячья сыворотка (Biochrom). Гиперсоленость (+ NaCl) была вызвана увеличением концентрации NaCl на 50 мМ NaCl по сравнению с исходной средой для культивирования клеток, включая добавки (NaCl, Sigma-Aldrich).В некоторых указанных экспериментах культуры Т-клеток проводили в присутствии рекомбинантных цитокинов (IL-6, 50 нг / мл; IL-12, 10 нг / мл; IL-4, 10 нг / мл; TGF-β, 5 нг). / мл; IL-1β, 10 нг / мл; IL-23, 50 нг / мл; все от R&D Systems) или нейтрализующие антитела (анти-IL-4, 10 мкг / мл; BD Biosciences). Наивные Т-клетки метили сукцинимидиловым эфиром диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в соответствии со стандартными протоколами и анализировали гейтингом на клетках CFSE ^low . Т-клетки стимулировали связанными с планшетом анти-CD3 (2 мкг / мл; клон TR66) и анти-CD28 (CD28.2, 2 мкг / мл; оба BD Biosciences) в течение 48 часов перед переносом в лунки без покрытия еще на 3 дня для общего периода культивирования 5 дней, если иное не указано в легендах. Клоны Т-клеток были созданы в неполяризующих условиях, как описано ранее, после осаждения отдельных клеток с помощью сортировки клеток с помощью проточной цитометрии или путем ограниченного разведения ( 49 ).

Анализ цитокинов и факторов транскрипции

Окрашивание внутриклеточных цитокинов и факторов транскрипции выполняли, как описано ранее ( 20 ).Клетки окрашивали антителами против цитокинов (IL-4, IL-13, IFN-γ, IL-17A и IL-5, все от BioLegend) и антителами против факторов транскрипции (GATA-3 и ROR-γt, eBioscience. ; T-bet, BioLegend) или поверхностные маркеры (IL-4R, R&D Systems; IL-12Rβ2, Miltenyi Biotec; CCR8, BioLegend) и анализировали с помощью BD LSRFortessa (BD Biosciences), CytoFLEX (Beckman Coulter) или MACSQuant Analyzer ( Miltenyi Biotec). Данные проточной цитометрии анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (TreeStar) или Cytobank (Cytobank Inc.). Цитокины в супернатантах культур измеряли с помощью ELISA (R&D Systems) или Luminex (eBioscience) в соответствии со стандартными протоколами после рестимуляции культивируемых Т-клеток с помощью PMA (50 нМ; Sigma-Aldrich) и связанных с планшетом анти-CD3 (1 мкг / мл. , TR66) в течение 8 часов или как указано в подписях к соответствующим рисункам. Счетные шарики (CountBright Absolute Counting Beads, Thermo Fisher Scientific) использовали для нормализации количества клеток, если выполнялся анализ кумулятивных супернатантов, полученных из 5-дневных культур клеток.

Анализ экспрессии генов

Набор для обратной транскрипции кДНК высокой емкости (Applied Biosystems) использовали для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) в соответствии с протоколом производителя. Транскрипты количественно оценивали с помощью ПЦР в реальном времени с помощью предварительно разработанных анализов экспрессии генов TaqMan (SGK1, Hs00985033_g1; NFAT5, Hs00232437_m1; TBX21, Hs00203436_m1; GATA3, Hs00231122_m1; RORC2, Hs0107; Обилие мРНК было нормализовано к количеству 18 S рибосомной РНК и выражено в условных единицах (A.У.). Анализ экспрессии генов в масштабе всего транскриптома был выполнен, как описано в дополнительных материалах и методах.

Замалчивание гена лентивируса

Бактериальные стоки, содержащие лентивирусные векторы с кшРНК, нацеленной против SGK1 и NFAT5 , были приобретены у Sigma-Aldrich. Все векторы были амплифицированы и очищены с использованием MaxiPrep или MidiPrep Kit (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Лентивирусные частицы были получены в клетках 293 эмбриональной почки человека (НЕК).Предусмотренные человеческие Т-клетки памяти (5 × 10 ⁴ ) были активированы на планшетах, покрытых анти-CD3 / CD28, в течение 12 часов перед трансдукцией супернатантами из культур с объединенными лентивирусными частицами против SGK1 и NFAT5 , без вставки shRNA или со скремблированной шРНК. Через 48 часов клетки промывали и отбирали пуромицином (Sigma-Aldrich). Экспрессию генов измеряли количественной ПЦР в реальном времени через 4 дня после трансдукции.

Количественная оценка концентрации натрия в коже

NAA в Forschungsneutronenquelle Heinz Maier-Leibniz (FRM II) в Мюнхене использовалась для обнаружения химических элементов в 4-миллиметровых замороженных биоптатах кожи (пораженных и не поврежденных).После нейтронного облучения измерялось испускание нескольких гамма-квантов характеристической энергии при распаде изотопов. Интенсивность характеристического гамма-излучения позволила определить активность (выраженную в беккерелях) излучателя. Активность A в конце нейтронной экспозиции связана с числом N атомов материнского изотопа в образце с помощью следующего уравнения: где ϕ — плотность потока тепловых нейтронов в 1 / (см ² с), σ — сечение активации изотопа в см ² , t — время облучения, а T _1/2 — период полураспада радиоизотопа в равных единицах.

Статистический анализ

Двусторонние парные и непарные тесты Стьюдента t , а также тесты Краскела-Уоллиса с множественными сравнениями Данна апостериорные тесты были использованы для статистических сравнений между двумя или более группами, соответственно, и их использование было указано в соответствующие подписи к рисункам, с полосами ошибок, указывающими на SEM. Значения P 0,05 или меньше считались значимыми. Анализы выполняли с помощью Prism 6 (GraphPad).

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

www.sciencetranslationalmedicine.org/cgi/content/full/11/480/eaau0683/DC1

Материалы и методы

Рис. S1. Жизнеспособность человеческих Т-клеток сохраняется в широком диапазоне концентраций NaCl.

Рис. S2. T _H 17 молекул сигнатуры клеток активируются при стимуляции памяти клеток T _H с помощью NaCl.

Рис. S3. NaCl увеличивает память T _H 2 клеточных ответов независимо от экзогенного или аутокринного IL-4.

Рис. S4.NaCl индуцирует повышающую регуляцию IL-4, IL-17, а также двойных положительных Т-клеток по IL-4 и IL-17.

Рис. S5. NaCl усиливает T _H 2 и подавляет клеточные ответы T _H 1 в клонах клеток T _H .

Рис. S6. Сравнение различных осмолитов показывает, что NaCl является наиболее мощным индуктором IL-4 и супрессором IFN-γ в Т-клетках памяти.

Рис. S7. Т-клетки памяти CD8 демонстрируют стабильную экспрессию IL-4 и IFN-γ при стимуляции NaCl, но повышают активность IL-17.

Рис. S8. Т-клетки кожи отличаются от Т-клеток крови и различаются экспрессией маркеров присутствия в тканях CD69 и CD103.

Рис. S9. NaCl индуцирует повышающую регуляцию хемокинового рецептора CCR8, который обогащает T _H 2-ассоциированные цитокины.

Рис. S10. Обогащение по всему транскриптому сигнатуры клеток T _H 2 с помощью NaCl.

Рис. S11. NaCl индуцирует поляризацию клеток T _H 2 независимо от экзогенного или аутокринного IL-4.

Рис. S12. Условия T _H 17-поляризующих цитокинов отменяют T _H 2-промотирующий эффект NaCl.

Рис. S13. Т-клетки мыши дифференцируются в клетки Т _H 2 в ответ на NaCl.

Рис. S14. SGK-1 является конечной целью NFAT5.

Рис. S15. GATA-3 и T-bet не регулируются NFAT5 и SGK-1 в условиях низкого содержания NaCl.

Рис. S16. Модель.

Таблица S1. Выбранные области и последовательности праймеров, используемые для анализов метилирования ДНК.

Таблица S2. Информация о пациенте.

Файл данных S1. Первичные данные.

Ссылки ( 50 — 54 )

Благодарности: Мы благодарим S. Wolff за координацию облучения кожи у источника нейтронной активации в Гархинге. Мы благодарим С. Хегенбарта за техническую помощь и К. Хойзера за критический обзор рукописи. Мы благодарим BMC Core Facility Flow Cytometry LMU в Мюнхене за предоставление оборудования и Core Facility Flow Cytometry Немецкого исследовательского центра ревматизма (DRFZ) в Берлине для сортировки клеток. Финансирование: Эта работа финансировалась Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Немецкий исследовательский фонд SFB1054 Teilprojekt B10 для CEZ, Teilprojekt B12 для DB, SFB1335 Teilprojekt P18 для CEZ, Teilprojekt P17 для TB, программа Emmy Noether BA 5132 / 1-1 DB и SFB TR156 до SG), Fritz-Thyssen Stiftung (для CEZ) и Немецкого центра исследований инфекций (для CEZ). Вклад авторов: Дж. Маттиас провел эксперименты с человеческими клетками, проанализировал и интерпретировал данные.J. Maul провел все эксперименты с мышиными клетками и вместе с D.B. проанализировал и интерпретировал данные. R.N., H.M., Y.-Y.C. и D.S. провели эксперименты и проанализировали данные. H.G., F.J., K.E., D.R. и H.M. выполнили измерения концентрации натрия с помощью NAA, проанализировали и интерпретировали данные. Г.Г. и Дж. провели эпигенетические эксперименты, проанализировали и интерпретировали данные. Г.Г. и А. выполнили секвенирование РНК следующего поколения (RNA-seq). К. обработали и проанализировали данные РНК-seq (ID: PRJNA503839).S.D. и П.К. провели дальнейший биоинформатический анализ с наборами транскриптомных данных, предоставленными K.N. N.G.-S., K.E., T.B. и S.G. предоставили биопсию кожи пациентов с атопическим дерматитом, охарактеризовали и оценили образцы пациентов. C.E.Z. задумал исследование, руководил экспериментами, интерпретировал данные и написал рукопись. Все авторы просмотрели и одобрили рукопись. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, относящиеся к этому исследованию, представлены в статье или дополнительных материалах.

• Copyright © 2019 Авторы, некоторые права защищены; эксклюзивный лицензиат Американской ассоциации содействия развитию науки. Отсутствие претензий к первоначальному государственному предприятию США

6 Натрий и хлорид | Нормы потребления воды, калия, натрия, хлоридов и сульфатов с пищей

Weir MR, Dengel DR, Behrens T, Goldberg AP. 1995. Повышение систолического артериального давления, вызванное солью, влияет на почечную гемодинамику и протеинурию. Гипертония 25: 1339–1344.

Велтон П.К., Бьюринг Дж., Борхани Н.О., Коэн Дж. Д., Кук Н., Катлер Дж. А., Кили Дж. Э., Куллер Л. Х., Саттерфилд С., Сакс Ф. М., Тейлор Дж. 1995. Влияние добавок калия на людей с высоким нормальным кровяным давлением: результаты фазы I испытаний по профилактике гипертонии (TOHP). Ann Epidemiol 5: 85–95.

Whelton PK, Perneger TV, He J, Klag MJ. 1996. Роль артериального давления как фактора риска почечной недостаточности: обзор эпидемиологических данных. J Hum Hypertens 10: 683–689.

Whelton PK, He J, Appel LJ, Cutler JA, Havas S, Kotchen TA, Roccella EJ, Stout R, Vallbona C, Winston MC, Karimbakas J. 2002. Первичная профилактика гипертонии: Рекомендации по клиническим и общественным вопросам здравоохранения от Национального совета Образовательная программа по артериальному давлению. J Am Med Assoc 288: 1882–1888.

Уиллоуби А., Граубард Б.И., Хокер А., Сторр С., Вьетце П., Такаберри Д.М., Джерри М.А., Маккарти М., Гист Н.Ф., Магенхайм М., Берендес Н., Роадс Г.Г.1990. Популяционное исследование результатов развития детей, подвергшихся воздействию детской смеси с дефицитом хлоридов. Педиатрия 85: 485–490.

Wilson M, Morganti AA, Zervoudakis J, Letcher RL, Romney BM, Von Oeyon P, Papera S, Sealey JE, Laragh JH. 1980. Артериальное давление, ренин-альдостероновая система и половые стероиды на протяжении нормальной беременности. Am J Med 68: 97–104.

Witteman JC, Willett WC, Stampfer MJ, Colditz GA, Sacks FM, Speizer FE, Rosner B, Hennekens CH.1989. Проспективное исследование факторов питания и гипертонии среди женщин. Тираж 8: 1320–1327.

Wolf-Maier K, Cooper RS, Banegas JR, Giampaoli S, Hense HW, Joffres M, Kastarinen M, Poulter N, Primatesta P, Rodriguez-Artalejo F, Stegmayr B, Thamm M, Tuomilehto J, Vanuzzo D, Vescio F. 2003. Распространенность гипертонии и уровни артериального давления в 6 европейских странах, Канаде и США. J Am Med Assoc 289: 2363–2369.

Ямори И, Хори Р.1994. Профилактика инсульта на уровне общины: улучшение питания в Японии. Представитель здравоохранения 6: 181–188.

Yamori Y, Nara Y, Mizushima S, Mano M, Sawamura M, Kihara M, Horie R. 1990. Международное совместное исследование взаимосвязи между диетическими факторами и артериальным давлением: отчет из исследования «Сердечно-сосудистые заболевания и сравнение пищевых продуктов» (CARDIAC). . J Cardiovasc Pharmacol 16: 43S – 47S.

Yamori Y, Nara Y, Mizushima S, Sawamura M, Horie R.1994. Факторы питания при инсульте и основных сердечно-сосудистых заболеваниях: Международное эпидемиологическое сравнение диетической профилактики. Представитель здравоохранения 6: 22–27.

Ямори Ю., Лю Л., Икеда К., Мидзусима С., Нара Ю., Симпсон Ф.О. 2001. Различные ассоциации артериального давления с 24-часовой экскрецией натрия с мочой у женщин в пре- и постменопаузе. J Hypertens 19: 535–538.

Ян Дж, Чжан Х, Чжао Л., Чжоу Б., Ву И, Чжан Х. 1997. Смертность от белков, соли и инсульта. Can J Cardiol 13: 44B.

You WC, Blot WJ, Chang YS, Ershow AG, Yang ZT, An Q, Henderson B, Xu GW, Fraumeni JF, Wang TG. 1988. Диета и высокий риск рака желудка в Шаньдуне, Китай. Cancer Res 48: 3518–3523.

Young DB, McCaa RE, Pan YJ, Guyton AC. 1976. Натрийуретическое и гипотензивное действие калия. Circ Res 38: 84S – 89S.