Кандид 1: Кандид инструкция по применению: показания, противопоказания, побочное действие – описание Candid р-р д/местн. прим. 1%: фл. 15 мл с пробкой-капельницей (1294)

Содержание

Кандид раствор для мест. прим. для полости рта 1% 15мл

Краткое описание

Противогрибковое, антибактериальное, противопротозойное, трихомонацидное средство.

Действующее вещество:
клотримазола 10 мг;
Вспомогательные вещества:
пропиленгликоль — 495 мг,
глицерин — 495 мг.

Противогрибковый препарат широкого спектра действия для местного применения, производное имидазола. Антимикотический эффект связан с нарушением синтеза эргостерина, входящего в состав клеточной мембраны грибов, что вызывает изменение ее структуры и свойств и приводит к лизису клетки.


К клотримазолу чувствительны дерматофиты, дрожжеподобные грибы (рода Candida, Torulopsis glabrata, Rhodotorula), плесневые грибы, а также возбудитель разноцветного лишая Pityriasis versicolor и возбудитель эритразмы.
Оказывает противомикробное действие в отношении грамположительных (стафилококки и стрептококки) и грамотрицательных бактерий (Bacteroides, Gardnerella vaginalis), а также в отношении Trichomonas vaginalis.
При местном применении клотримазола абсорбция клотримазола со слизистых оболочек незначительна.

Кандидозный стоматит.

10-20 капель (0.5-1 мл) препарата Кандид наносят на пораженные участки полости рта 3-4 раза/сут, желательно с помощью ватной палочки. Улучшение состояния наступает обычно на 3-5 день лечения, однако лечение необходимо продолжить до полного устранения клинических проявлений заболевания.

Препарат обычно хорошо переносится.
В редких случаях, при гиперчувствительности к компонентам препарата, отмечаются аллергические реакции — покраснение слизистой оболочки полости рта, ощущение жжения и покалывания на месте нанесения препарата, крапивница. При возникновении раздражения препарат необходимо отменить.

Гиперчувствительность к компонентам препарата.

Острая передозировка при местном применении Кандида маловероятна и не приводит к ситуации, представляющей угрозу для жизни.

Кандид предназначен только для местного применения в полости рта.

При одновременном применении с амфотерицином В, нистатином активность клотримазола может снижаться.

Кандид — крем для наружного применения,раствор для наружного применения,таблетки вагинальные,порошок для наружного применения,раствор для местного применения,гель вагинальный, 2%,1%,10 мг/г,500 мг,1%,1%, инструкция, способ применения и дозы, побочные действия, отзывы о препарате — Энциклопедия лекарств РЛС

Фармакологическое действие — противогрибковое.

Фармакодинамика

Клотримазол — производное имидазола, противогрибковое средство широкого спектра действия. Противогрибковый эффект связан с нарушением синтеза эргостерина, входящего в состав клеточной мембраны грибов, что вызывает изменение ее структуры и свойств и приводит к лизису клетки.

В низких концентрациях действует фунгистатически, в высоких фунгицидно, причем не только на пролиферирующие клетки. В фунгицидных концентрациях взаимодействует с митохондриальными и пероксидазными ферментами, в результате чего происходит увеличение концентрации перекиси водорода до токсического уровня, что также способствует разрушению грибковых клеток.

Эффективен в отношении дерматофитов (Epidermophyton, Microsporum, Trichophyton), дрожжеподобных (в основном Candida albicans), плесневых грибов и простейших, а также возбудителя разноцветного лишая Pityriasis versicolor и возбудителя эритразмы. Оказывает антимикробное действие в отношении грамположительных микроорганизмов и анаэробов. Клотримазол не оказывает влияния на лактобациллы. При местном применении адсорбция клотримазола со слизистых оболочек незначительна.

Показания препарата Кандид

Кандидозный стоматит.

Противопоказания

Гиперчувствительность к клотримазолу и другим компонентам препарата.

Применение при беременности и кормлении грудью

Данные о применении препарата у беременных женщин ограничены. При клинических и экспериментальных исследованиях не было установлено, что клотримазол оказывает отрицательное влияние на здоровье женщины или плода. Клотримазол в лекарственной форме раствор для местного применения противопоказан для применения в I триместре беременности. Вопрос о целесообразности применения препарата во II и III триместрах беременности должен решаться индивидуально после консультации врача.

Клинические данные о применении препарата у кормящих женщин ограничены. Экспериментальные исследования на животных свидетельствуют о том, что клотримазол экскретируется в грудное молоко. Риск для ребенка полностью не исключен. Вопрос о целесообразности применения препарата в период грудного вскармливания должен решаться индивидуально после консультации врача, если потенциальная польза для матери превосходит возможный риск для ребенка. При необходимости следует решать вопрос о прекращении грудного вскармливания.

Побочные действия

Препарат обычно хорошо переносится. В редких случаях, при гиперчувствительности к компонентам препарата, отмечаются аллергические реакции — покраснение слизистой оболочки полости рта, ощущение жжения и покалывания на месте нанесения препарата, крапивница. При возникновении раздражения препарат необходимо отменить.

Если любые из указанных в инструкции побочных эффектов усугубляются или замечены любые другие побочные эффекты, не указанные в инструкции, следует сообщить об этом врачу.

Взаимодействие

При одновременном применении с амфотерицином В, нистатином, активность клотримазола может снижаться.

Если пациент применяет вышеперечисленные или другие лекарственные препараты (в т.ч. безрецептурные) перед применением препарата Кандид необходимо проконсультироваться с врачом.

Способ применения и дозы

Местно. Только для стоматологического применения. Перед использованием проколоть наконечник флакона. 10–20 капель (0,5–1 мл) препарата наносят на пораженные участки полости рта 3–4 раза в день с помощью ватной палочки. После нанесения препарата следует воздержаться от питья и приема пищи. Улучшение состояния наступает обычно на 3–5-й день лечения, однако лечение необходимо продолжить до полного устранения клинических проявлений заболевания. Если после лечения улучшения не наступает или появляются новые симптомы, необходимо проконсультироваться с врачом.

Применять препарат следует только согласно тому способу применения и в тех дозах, которые указаны в инструкции. В случае необходимости проконсультироваться с врачом.

Передозировка

При применении препарата в соответствии с инструкцией по применению передозировка маловероятна. Случаи передозировки при местном применении клотримазола не описаны.

При случайном приеме препарата внутрь необходимо провести симптоматическую терапию.

Особые указания

Препарат предназначен только для местного применения в полости рта.

Влияние на способность управлять транспортными средствами, механизмами. Нет данных об отрицательном влиянии препарата на способность к выполнению потенциально опасных видов деятельности, требующих повышенной концентрации внимания и быстроты психомоторных реакций.

Форма выпуска

Раствор для местного применения, 1%. В ПЭ-флаконе с встроенной пробкой-капельницей из ПЭ, завинчивающимся пластиковой пробкой, 15 мл. 1 флакон вместе с инструкцией по применению помещают в пачку из картона.

Производитель

Гленмарк Фармасьютикалз Лтд., Индия/Glenmark Pharmaceuticals Ltd.

Фактический адрес места производства лекарственного препарата. Plot № Е 37, 39, MIDC Area, Satpur, Nasik-422007, Maharashtra, India.

Наименование и адрес юридического лица, на имя которого выдано регистрационное удостоверение. Гленмарк Фармасьютикалз Лтд., Индия/Glenmark Pharmaceuticals Ltd., India. В/2 Mahalaxmi Chambers, 22 Bhulabhai Desai Road, Mahalaxmi, Mumbai-400026, India.

Претензии потребителей направлять по адресу: ООО «Гленмарк Импэкс», 115114, Москва, ул. Летниковская, 2, стр. 3, 2-й эт.

Тел.: (499) 951-00-00.

www.glenmark-pharma.ru

Условия отпуска из аптек

В защищенном от света месте, при температуре не выше 25 °C

Хранить в недоступном для детей месте.

Не применять по истечении срока годности, указанного на упаковке.

Пауль Клее — 212 произведений

Пауль Клее (нем. Paul Klee [kleː], 18 декабря 1879, Мюнхенбухзее, под Берном — 29 июня 1940, Локарно) — немецкий и швейцарский художник, график, теоретик искусства, одна из крупнейших фигур европейского авангарда. Гражданин Германии, Клее родился, провёл значительную часть жизни и умер в Швейцарии.

Отец — преподаватель музыки, мать — певица, от них страсть к скрипке и вокалу передалась сыну. С 1898 Клее учился живописи в Мюнхене, с 1900 — в Академии изящных искусств вместе с Кандинским. В Италии открыл для себя архитектуру и живопись Ренессанса (прежде всего — Микеланджело), в Мюнхене — Гойю, Блейка, Энсора, Ван Гога и Сезанна. В 1911 вошел в экспрессионистскую группу «Синий всадник», познакомился с Арпом. В 1912 в Париже встретился с Робером Делоне, увидел работы Пикассо, Руссо, Брака. Большое впечатление на художника произвела поездка в 1914 в Тунис; его работа с восточными мотивами близка аналогичным поискам Матисса. В 1915 познакомился с Р. М. Рильке. В 1916—1918 участвовал в Первой мировой войне, но служил далеко от фронта.

В 1920 году вышло издание повести Вольтера «Кандид» с иллюстрациями Клее. В 1921—1930 годах преподавал в Баухаусе. В 1925 году участвовал в парижской выставке сюрреалистов. В 1933 году под давлением нацистов был вынужден отказаться от места профессора в Дюссельдорфской художественной академии и вернулся в Швейцарию. Клее подал заявление о вступлении в гражданство этой страны, однако положительный ответ на запрос пришёл лишь после смерти художника.

В 1935 году большая экспозиция работ Клее прошла в Берне, в том же году у него были обнаружены признаки склеродермии, от которой он позже и умер. В 1937 году 17 его работ фигурировали на пропагандистской выставке нацистов «Дегенеративное искусство». В 1940 году состоялась последняя большая прижизненная выставка мастера в Цюрихе.

Имя Пауля Клее носит выставочный центр в Берне.

Был похоронен в Лугано, через несколько лет урна с прахом перенесена на кладбище в Берне.

В наследие Клее входят около 9000 работ. Связанный с экспрессионистами, он тем не менее был близок таким мастерам, как Гойя, Блейк, Энсор, Мунк, французские сюрреалисты.

Жена (с 1906) — пианистка Лили Клее (урождённая Каролина Штумпф). У супругов был один сын — Феликс.

Это часть статьи Википедии, используемая под лицензией CC-BY-SA. Полный текст статьи здесь →


ещё . ..

норма, отклонения, что это за микроорганизм

Инфекционно-патогенный грибок, вызывающий грибковые инфекции в организме у женщин и мужчин, называется Candida spp. Этот род дрожжевых грибов имеет множество разновидностей, поэтому для адекватного лечения и предотвращения рецидивов важно идентифицировать возбудителя и начать соответствующее лечение. Самостоятельно справляться болезнями, которые вызывают грибы рода Candida не рекомендуется, так как ситуация грозит тяжелыми последствиями.

Чтобы найти в организме грибковую инфекцию, проводится лабораторное диагностическое исследование, которое поможет определить разновидность патогена, что важно при выборе медикаментозной терапии.

Что это за микроорганизм?

Candida spp — род дрожжевых грибковых микроорганизмов, которые чаще всего вызывают различные микозные заболевания у человека. Почти все разновидности грибка Кандида присутствуют в организме здорового человека, и при достаточной иммунной защите, не вызывают опасных заболеваний и нарушений. Как только иммунитет становится слабым, грибки активируют свою жизнедеятельность, провоцируя развитие грибково-инфекционных заболеваний. Чаще всего у человека встречается грибок Candida albicans, который провоцирует всем известный недуг молочницу. Другие разновидности грибков рода Кандида встречаются реже.

Вернуться к оглавлению

Как находят кандиду spp?

Комплексная диагностика включает в себя посев на дрожжеподобный грибок.

Информативный, многофункциональный и эффективный считается анализ посева на дрожжеподобные грибы. Для исследования берется разовая порция мочи, мазок из слизистых половых органов или ротоносоглотки, образец пораженного ногтя или эякулят. Далее образец помещают в специфическую питательную среду, где он развивается и растет. В течение 3—4-х дней миколог уже будет иметь результаты и данные, которые касаются разновидности возбудителя.

Чтобы результаты были максимально точными, до взятия образцов на анализ пациенту не приписываются никакие противогрибковые препараты. Поэтому перед визитом к врачу запрещено любое самолечение и употребление лекарств на свое усмотрение. Если мазок будет браться из уретры, то за 1,5—2 часа перед анализами больному не рекомендуется мочиться.

Посев обладает высокой точностью, дает возможность подобрать наиболее эффективный противогрибковый препарат, который поможет избавить от симптомов в короткие сроки. Для этого на выращенные грибки наносят противомикозный препарат и наблюдают за поведением микроорганизмов. То лекарство, которое в кратчайшие сроки уничтожило грибки, применяется в дальнейшей терапии.

Вернуться к оглавлению

Норма и отклонения

В норме в образцах здорового человека могут присутствовать грибки Кандида. Однако их количество не должно превышать 10 во 2 степени КОЕ/мл. Следующие значения показателей характеризует степень зараженности организма человека:

  • 10 в 3 степени — нормальное значение;
  • 10 в 4 степени — количество грибков умеренное;
  • 10 в 5 степени — у человека диагностирован кандидоз.

Если обнаружено Candida albicans 10 в 6 степени — заболевание протекает в запущенной стадии с осложнениями.

После того как диагноз «кандидоз» будет подтвержден, доктору важно будет выяснить превопричину развития патологии, чтобы устранить предрасполагающие факторы и устранить опасность рецидива в будущем. Пациенту назначается специальная противогрибковая терапия и лечебная диета, которая поможет ускорить выздоровление. Человек будет считаться здоровым, если в образце грибков будет не больше 10 в 3 степени КОЕ/мл.

 

Ольга Сумская поделилась архивными снимками с мужем и старшей дочерью

Ольга и Виталий Борисюк вместе более 25 лет.

Сумская и Борисюк вместе более 25 лет.

instagram olgasumska

Украинская актриса Ольга Сумская решила поделиться архивными пленочными снимками, как она с мужем Виталием Борисюком, маленькой дочкой Антониной Паперной и свекровью праздновали Новый год 25 лет назад. Народная артистка показала архивные фото в Инстаграме.

Ольга Сумская и Виталий Борисюк 25 лет назад.

instagram olgasumska

У них произошел служебный роман во время работы над музыкальным спектаклем «Кандид».

instagram olgasumska

Читай также: Сумская без макияжа показала подготовку к Новому году

На фотографиях счастливые влюбленные Ольга и Виталий выглядят очень по-семейному. Антонина Паперная, дочь от первого брака актрисы с Евгением Паперным, сидит на плечах у мужа мамы. Стоит отметить, как молодо выглядят артисты, а Ольга практически не изменилась в лице. Поклонники отмечают, как искрятся глаза у пары. Судя по дате и возрасту маленькой Тони, отношения пары как раз были только на начальном этапе.

Тоня — дочь от первого брака Сумской.

instagram olgasumska

«Наш из Виталием Борисюком Новый год 25 лет назад. Приятно вспоминать. Стол накрытый мамой Виталика, Линой Петровной. Какая же была хозяйка! Я многому у свекрови научилась… Счастливые годы,» — подписала серию снимков Ольга.

Влюбленная пара рядом с мамой Борисюка.

instagram olgasumska

Читай также: Сумская рассказала, как ее бывший муж узнал об измене

Ольга Сумская и Виталий Борисюк вместе более 25 лет. В 2002 году у пары родилась дочь Аня. Также у Ольги есть дочь от актера Евгения Паперного — Антонина. Первые годы жизни девочка была у родителей актрисы. В 12 лет Тоня полностью переехала к звездной маме. Сейчас Антонина строит карьеру в РФ как актриса, имеет ребенка от актера Владимира Яглыча, с которым долгое время в отношениях.

Ранее мы писали, что Антонина решила кардинально сменить прическу. По словам актрисы, она мечтала об этой неожиданной для публики прическе около 7 лет, а теперь исполнила свою мечту.

свята і пости на кожен день


Січень

1 Сб. Перед Різдвом. Мч. Воніфатія. Мчч. Іллі, Прова та Ариса. Свт. Григорія. Новий рік.

2 Нд. 28-ма по 50-ниці. Святих отців. Перед Різдвом. Сщмч. Ігнатія Богоносця. Прп. Ігнатія Печерського. Свт. Філогонія.

3 Пн. Мц. Юліанії. Свт. Петра, митр. К. і всієї Руси.

4 Вт. Вмц. Анастасії Узорішительниці. Мчч. Хрисогона, Феодотії, Євода, Євтихіана.

5 Ср. Пам’ять дев’яти мучеників Критських: Феодула, Зотика та ін. Прп. Ніфонта.

6 Чт. Свят-вечір. Правв. Євгенії, Прота, Якинфа, Клавдії. Строгий піст.

7 Пт. РІЗДВО ГОСПОДА НАШОГО ІСУСА ХРИСТА. Загальниця між свят.

8 Сб. Після Різдва Христового. Собор Пресвятої Богородиці. Сщмч. Єфимія.

9 Нд. 29-та по 50-ниці. Після Р.Х. Архидиякона Стефана. Йосифа Обручника, царя Давида та ап. Якова. Прп. Феодора Начертанного.

10 Пн. 20 000 мчч. у Нікомидії спалених: Зінона, Дорофея та ін. Ап. Никанора.

11 Вт. Свв. 14 000 немовлят, убитих Іродом у Вифлеємі. Прп. Іова Манявського.

12 Ср. Мц. Анисії. Сщмч. Зотика пресвітера. Ап. з 70-ти Тимона. Мч. Філітера.

13 Чт. Прп. Меланії.

14 Пт. ОБРІЗАННЯ ГОСПОДНЄ. Свт. Василія Великого. Свт. Петра (Могили). Новий рік за старим стилем.

15 Сб. Перед Богоявленням. Прав. Сильвестра. Кончина прп. Серафима Саровського.

16 Нд. 30-та по 50-ниці. Перед Богоявленням. Проп. Малахії. Мч. Гордія.

17 Пн. Собор 70-ти апостолів: Якова, Марка, Луки, Клеопи та ін.

18 Вт. Хрещенський свят-вечір. Проп. Михея. Сщмч. Феопемпта. Прп. Григорія.

19 Ср. СВЯТЕ БОГОЯВЛЕННЯ. ХРЕЩЕННЯ ГОСПОДА БОГА І СПАСИТЕЛЯ НАШОГО ІСУСА ХРИСТА

20 Чт. Собор Предтечі і Хрестит. Господнього Іоана.

21 Пт. Прпп. Георгія, Домніки та ін. Сщмч. Ісидора.

22 Сб. Після Богоявлення. Мч. Полієвкта. Прп. Євстратія. Проп. Самея.

23 Нд. 31-ша по 50-ниці. Після Богоявлення. Свтт. Григорія, Феофана. Прпп. Маркіана, Макарія, Дометіана.

24 Пн. Прпп. Феодосія Великого і Михаїла.

25 Вт. Мц. Тетяни. Свт. Сави, архиєп. Сербського. Мчч. Мчч. Мертія і Петра.

26 Ср. Мчч. Єрмила, Стратоніка, Петра. Прп. Якова.

27 Чт. Рівноап. Ніни, просвітительки Грузії. Прпп. Йосифа, Феодула, Стефана, Ісаї.

28 Пт. Прпп. Павла Фівейського та Іоанна Кущника. Прмч. Пансофія. Прп. Прохора.

29 Сб. Покоління чесним кайданам ап. Петра. Прав. Максима.

30 Нд. 32-га по 50-ниці. Прп. Антонія Великого.

31 Пн. Свтт. Афанасія та Кирила, архиєпп. Олександрійських. Прп. Маркіана.

Лютий

1 Вт. Прпп. Макарія Єгип. Макарія Печерськ. Свтт. Марка і Арсенія. Мц. Євфрасії.

2 Ср. Прп. Євфимія Вел., Лаврентія Печерського. Мчч. Іни, Пінни, Римми. Мч. Васса.

3 Чт. Прп. Максима Сповідника. Мчч. Євгенія, Валеріана, Неофіта, Кандида, Акили.

4 Пт. Ап. Тимофія. Прмч. Анастасія. Прп. Макарія. Мчч. Мануїла, Георгія, Петра.

5 Сб. Сщмч. Климента. Мч. Агафангела.

6 Нд. 33-тя по 50-ниці. Прп. Ксенії. Мчч. Вавіли, Тимофія, Агапія. Прп. Македонія.

7 Пн. Свт. Григорія Богослова. Сщмч. Володимира, митр. Київського. Прп. Мара.

8 Вт. Прпп. Ксенофонта, дружини його Марії та їх синів Аркадія та Іоана.

9 Ср. Перенесення мощів свт. Іоана Золотоустого.

10 Чт. Прпп. Єфрема Сирійця, Феодосія, Ісаака, Єфрема, Паладія.

11 Пт. Перенесення мощів сщмч. Ігнатія Богоносця. Прп. Лаврентія. Мч. Романа.

12 Сб. Собор трьох святителів: Василія Великого, Григорія Богослова та Іоана Золотоустого.

13 Нд. Про митаря і фарисея. Мчч. Кира та Іоана. Свт. Микити. Мчч. Віктора, Никифора, Клавдія. Загальниця.

14 Пн. Мч. Трифона. Прпп. Петра, Вендиміана. Мцц. Перпетуї, Феліцитати.

15 Вт. СТРІТЕННЯ ГОСПОДА НАШОГО ІСУСА ХРИСТА.

16 Ср. Прав. Симеона та пророчиці Анни. Прор. Азарії. Мчч. Папія, Диодора, Власія.

17 Чт. Прп. Ісидора. Блгв. князя Георгія. Сщмч. Аврамія. Прп. Миколая. Мч. Копрія.

18 Пт. Свт. Феодосія, архиєп. Чернігівського. Мц. Агафії.

19 Сб. Прпп. Вукола і Варсонофія. Свт. Фотія.

20 Нд. Про блудного сина. Прпп. Луки та Парфенія.

21 Пн. Вмч. Феодора Стратилата. Прор. Захарії. Свт. Сави.

22 Вт. Мч. Никифора. Прп. Панкратія Києво-Печерського. Прп. Геннадія.

23 Ср. Сщмч. Харалампія та замучених з ним: Порфирія і Вантоса. Прп. Прохора.

24 Чт. Сщмч. Власія, єп. Севастійського. Прп. Димитрія. Прав. Феодори.

25 Пт. Свтт. Мелетія, Антонія. Свт. Олексія Київського. Свт. Антонія.

26 Сб. Вселенська заупокійна. Прпп. Мартиніана, Зої, Світлани.

27 Нд. М’ясопусна. Рівноап. Кирила. Прпп. Авксентія, Мирона та Ісаакія. Загальниця сирна.

28 Пн. Ап. від 70-ти Онисима. Прпп. Пафнутія, Євсевія, Єфросинії.

Березень

1 Вт. Мчч. Валента, Павла, Порфирія, Селевкія, Феодула, Юліана, Самуїла, Іллі.

2 Ср. Прав. Маріамни. Прп. Феодора Києво-Печерського.

3 Чт. Свтт. Льва, Агапита, Флавіана. Прп. Косми.

4 Пт. Апп. від 70-ти: Архипа і Филимона. Мч. Максима.

5 Сб. Прп. Агафона. Свт. Льва.

6 Нд. Сиропусна. Прощена. Адамове вигнання. Свтт. Євстафія та Георгія. Початок Великого посту.

7 Пн. Мчч. Маврикія і 70-ти воїнів. Филипа, Фотина, Феодора та ін. Прп. Афанасія.

8 Вт. Феодора Тирона. Перше і друге знайдення голови Іоана Предтечі. Прп. Іоана.

9 Ср. Прп. Єразма.

10 Чт. Свт. Тарасія.

11 Пт. Свт. Порфирія. Прп. Севастіана.

12 Сб. Поминання померлих. Вмч. Феодора Тирона. Прпп. Тита, Прокопія, Фалалея.

13 Нд. 1-ша Великого посту. Торжества Православ’я. Прпп. Василія сповідника і Касіяна Римлянина. Сщмчч. Партерія і Нестора.

14 Пн. Прмц. Євдокії. Мчч. Нестора, Маркела, Антонія. Мц. Антоніни. Прп. Домніни.

15 Вт. Свт. Іова (Борецького). Сщмч. Феодота (Богдана). Прп. Агафона Єгипетськ.

16 Ср. Мчч. Євтропія, Клеоника, Василіска. Прп. Піами. Свв. Зінона і Зоїла.

17 Чт. Прпп. Якова, Герасима, Йосифа. Мчч. Павла і Юліанії. Блгв. В’ячеслава.

18 Пт. Мчч. Конона, Онисія. Прпп. Марка, Ісихія.

19 Сб. Поминання померлих. Пам’ять 42-х мучеників Аморійських. Знайдення Хреста і цвяхів св. Єленою (326 р.).

20 Нд. 2-га Великого посту. Свт. Григорія Палами. Сщмчч. Василія, Єфрема, Капітона, Євгенія, Єферія, Єлпидія, Агафодора.

21 Пн. Прпп. Феофілакта, Лазаря, Дометія. Сщмч. Феодорита.

22 Вт. 40-ка мучеників Севастійських. Св. Кисарія. Прав. Тарасія, Мч. Урпасіана.

23 Ср. Мчч. Кодрата, Анекти, Кипріана, Леоніда, Василіси, Ніки, Галі, Галини та ін.

24 Чт. Прп. Софронія. Свт. Софронія. Сщмч. Піонія. Мч. Єпимаха.

25 Пт. Прп. Феофана. Свт. Григорія Двоєсл. Прав. Фінеєса.

26 Сб. Поминання померлих. Мц. Христини. Прп. Аніна.

27 Нд. 3-тя Великого посту. Хрестопоклінна. Прп. Венедикта. Свт. Феогноста Київського.

28 Пн. Мчч. Агапія, Публія, Ромила, Тимолая, Никандра. Сщмч. Олександра.

29 Вт. Мчч. Савіна, Юліана. Ап. Аристовула. Сщмчч. Трофима і Фала.

30 Ср. Прп. Олексія, чоловіка Божого. Прп. Макарія. Мч. Марина.

31 Чт. Свт. Кирила, архиєп. Єрусалимського. Мчч. Трофима і Євкарпія.

Квітень

1 Пт. Мчч. Хрисанфа, Дарії, Клавдія, Трибуна, Ясона, Мавра, Панхарія.

2 Сб. Поминання померлих. Прпп. Сергія Патрикія, Іоана.

3 Нд. 4-та Великого посту. Прп. Іоана Ліствичника. Прп. Якова. Свтт. Кирила і Фоми Царгородських.

4 Пн. Сщмч. Василія. Прп. Ісаакія. Мц. Дросиди.

5 Вт. Прмч. Никона. Мц. Лідії. Мчч. Филита, Македона, Кронида, Амфілохія.

6 Ср. Прп. Захарії. Свт. Артемія. Прав. Якова. Поклони.

7 Чт. БЛАГОВІЩЕННЯ ПРЕСВЯТОЇ БОГОРОДИЦІ.

8 Пт. Собор Архангела Гавриїла.

9 Сб. Акафісна. Мц. Макрони.

10 Нд. 5-та Великого посту. Прп. Марії Єгипетської. Прп. Іларіона. Прмчч. Євстратія та Іони.

11 Пн. Мчч. Марка та Кирила. Прп. Іоана. Свт. Євстратія.

12 Вт. Врп. Іоада. Свт. Софронія. Ап. Сосфена.

13 Ср. Свмчч. Іпатія, Авди, Веніаміна. Прп. Аполонія.

14 Чт. Мч. Авраамія.

15 Пт. Прп. Тита чудотворця. Мчч. Полікарпа, Амфіана і Єдесія.

16 Сб. Лазарева. Воскресіння Праведного Лазаря. Микити сповідника.

17 Нд. 6-та Великого посту. ВХІД ГОСПОДНІЙ У ЄРУСАЛИМ. Прпп. Йосифа піснеписця. Прпп. Георгія і Зосима. Мц. Фервуфи.

18 Пн. Страсний тиждень. Мч. Агафопода. Прпп. Марка, Платона. Пуплія, Симиона.

19 Вт. Свтт. Мефодія, Євтихія. Прп. Платониди. Мчч. Ієремія і Архилія.

20 Ср. Юдина зрада Ісуса Христа. Прпп. Георгія та Даниїла. Мчч. Каліопія і Руфина. Мц. Акилини.

21 Чт. Спомин про Тайну Вечерю. Апп. Іродіона, Агава, Єрма, Асинкрита. Мч. Павсилина. Свт. Килистина.

22 Пт. Спомин про розп’яття І. Христа. Винесення Плащаниці. Прмч. Вадима. Мчч. Євпсихія, Дисана.

23 Сб. Мчч. Терентія, Максима, Зінона, Помпія, Африкана, Якова.

24 Нд. ПАСХА. ВОСКРЕСІННЯ ІСУСА ХРИСТА. Прп. Сщмч. Антипи. Прпп. Якова, Фарнуфія, Іоана. Мчч. Прокеса і Мартиніана. Загальниця.

25 Пн. Прпп. Василія, Ісаака Сирійця, Анфуси і Афанасії.

26 Вт. Сщмч. Артемона пресвітера. Мц. Фомаїди.

27 Ср. Свт. Мартина сповідника. Мчч. Іоана, Антонія, Євстафія і Ардаліона.

28 Чт. Апп. з 70-ти Аристарха, Пуда і Тимофія. Мц. Василиси. Св. Мстислава.

29 Пт. Мцц. Агапії, Ірини, Хіонії, Галини, Каліси, Василіси, Ірини, Ніки, Мч. Леоніда.

30 Сб. Сщмч. Симеона, єп. Персидського. Мчч. Авдилая і Азата.

Травень

1 Нд. Апостола Фоми. Мчч. Віктора, Зотика, Зинона, Акиндина, Северіана. Прпп. Авксентія та Іоана.

2 Пн. Мчч. Феони, Христофора, Антоніна. Сщмч. Пафнутія. Прп. Іоана. Свт. Трифона.

3 Вт. Поминання померлих. Прпп. Феодора Трихіни. Свтт. Григорія і Анастасія.

4 Ср. Сщмчч. Януарія, Прокула, Сосія, Фауста, Дисидерія, Євтихія, Акутіона.

5 Чт. Апп. Нафанаїла, Луки та Климента. Прп. Віталія.

6 Пт. Вмч. Юрія Переможця. Мчч. Анатолія, Протолеона. Мц. Олександри.

7 Сб. Мч. Сави Стратилата і з ним 72-ох воїнів. Прп. Сави.

8 Нд. Жінок Мироносиць. Ап. Марка. Прп. Сильвестра.

9 Пн. Сщмч. Василія, єп. Амасійського. Прав. Глафірию Прп. Іоаникія.

10 Вт. Ап. і сщмч. Симеона. Прп. Стефана.

11 Ср. Апп. з 70-ти: Ясона і Сосипатра, Керкири. Мчч. Дади, Максима, Віталія.

12 Чт. Пам’ять 9-ти мучеників Кизицьких. Феогнида, Руфа, Антипатра, Артема.

13 Пт. Ап. Яковап Заведеєвого. Свтт. Доната і Василія.

14 Сб. Прор. Єремії. Сщмч. Макарія. Св. Тамари. Прмч. Євфимія.

15 Нд. Про розслабленого. Свт. Афанасія Великого. Благовірних князів Бориса та Гліба. Мч. Єспера.

16 Пн. Мчч. Тимофія і Маври. Прп. Феодосія Печерського. Прп. Петра.

17 Вт. Мц. Пелагії діви. Прпп. Микити, Климента, Никифора, Кирила і Ісаакія.

18 Ср. Мц. Ірини. Прп. Якова. Половина до П’ятидесятниці.

19 Чт. Праведного Іова Багатостраждального. Прп. Іова Поч. Мчч. Варвара і Вакха.

20 Пт. Спомин про з’явлення на небі Хреста Господнього в Єрусалимі. Мч. Акакія.

21 Сб. Ап. Іоана Богослова. Прпп. Арсенія Вел. і Пимена Печ.

22 Нд. Про Самарянку. Проп. Ісаї. Мч. Христофора. Перенес. мощів свт. Миколи в м. Барі.

23 Пн. Ап. Симона Зилота. Мч. Ісихія. Мчч. Алфія, Кипріана, Онисима, Єразма.

24 Вт. Рівноапп. Мефодія і Кирила, учителів слов’ян. Сщмч. Мокія. Прп. Софронія.

25 Ср. Свтт. Єпіфанія, Германа, Савина і Полувія.

26 Чт. Мц. Гликерії діви. Мчч. Лаодикія і Олександра. Св. Георгія. Прп. Євфимія.

27 Пт. Мч. Ісидора. Прпп. Серапіона Синдоніта, Микити Печ. Свт. Леонтія.

28 Сб. Прпп. Пахомія Великого і Ахиллія.

29 Нд. Про сліпонародженого. Прп. Феодора Освяченого. Мчч. Модеста, Віта, Крискентії.

30 Пн. Ап. Андроника і св. Юнії. Мчч. Солохана і Памфамира. Свт. Стефана.

31 Вт. Мчч. Феодота, Симеона, Іраклія і Давида. Мцц. Текуси, Клавдії, Фаїни, Юлії.

Червень

1 Ср. Патрикія, єп. Пруського. Прп. Корнилія чудотворця. Мчч. Акакія і Менандра.

2 Чт. ВОЗНЕСІННЯ ГОСПОДНЄ. Мчч. Фалалея, Астерія, Аскалона і Олександра. Свт. Олексія.

3 Пт. Рівноап. царя Костянтина і матері його Єлени.

4 Сб. Мчч. Василиска, Іоана-Володимира, кн. Серб.

5 Нд. Святих Отців 1-го Всесвітнього Собору. Пррп. Михаїла, Євфросинії. Прп. Паїсія Галицького.

6 Пн. Прп. Симеона Стовпн. Мчч. Мелетія, Стефана, Калиника, Феодора і Фауста.

7 Вт. Третє знайдення голови Іоана Предтечі. Сщмч. Ферапонта.

8 Ср. Апп. від 70-ти: Карпа й Алфея. Мчч. Аверкія і Єлени. Прп. Іоана.

9 Чт. Сщмч. Ферапонта. Прав. Іоана Руського. Свтт. Кипріана, Фотія Київських.

10 Пт. Прп. Микити. Сщмчч. Євтихія, Елладія. Мц. Єликониди.

11 Сб. Всесвітня заупокійна. Свт. Луки. Мц. Феодосії.

12 Нд. ПРЕСВЯТОЇ ТРОЙЦІ. СХОДЖЕННЯ СВЯТОГО ДУХА НА АПОСТОЛІВ. Прп. Ісаакія спов.

13 Пн. День Святого Духа. Ап. з 70-ти: Єрма. Мч. Єрмія. Загальниця.

14 Вт. Мчч. Юстина Філософа, Харитона, Харити. Прп. Агапіта, лікаря Печер.

15 Ср. Свт. Никифора. Вмч. Іоана Сучавського.

16 Чт. Мчч. Клавдія, Іпатія, Лукиліана, Павла, Дионисія. Сщмчч. Лукіана, Максіана.

17 Пт. Свт. Митрофана. Прп. Зосими. Сщмч. Астія. Мчч. Конкордія, Фронтасія.

18 Сб. Сщмч. Дорофея. Блж. Костянтина.

19 Нд. 1-ша по 50-ниці. Всіх святих.

20 Пн. Сщмчч. Феодота, Маркеліана. Мчч. Клавдія, Кирина, Антонія. Мц. Валерії.

21 Вт. Вмч. Феодора Стратилата. Прпп. Єфрема і Зосими.

22 Ср. Свт. Кирила. Мцц. Марфи, Фекли і Марії.

23 Чт. Прп. Силуана схимника. Свт. Вассіана, єп. Лавдійського. Сщмч. Тимофія.

24 Пт. Сщмч. Апп. Варфоломея та Варнави.

25 Сб. Прпп. Онуфрія Великого, Петра, Іоана, Андрія, Іраклемона.

26 Нд. 2-га по 50-ниці. Всіх святих Руси-України. Мц. Антоніни. Свт. Трифілія. Прп. Анни.

27 Пн. Проп. Єлисея. Свт. Мефодія, патр. Царгородського.

28 Вт. Прор. Амоса. Блж. Августина. Прп. Дули. Мчч. Віта, Модеста і Крискентії.

29 Ср. Свт. Тихона, єп. Амафунтського. Прп. Тихона. Сщмч. Тигрія. Мч. Євтропія.

30 Чт. Мчч. Мануїла, Савела та Ісмаїла.

Липень

1 Пт. Мчч. Леонтія, Іпатія і Феодула. Прп. Леонтія.

2 Сб. Ап. Юди, брата Господнього. Прпп. Варлаама, Паїсія і Іоана.

3 Нд. 3-тя по 50-ниці. Сщмч. Мефодія. Свтт. Мини і Левкія. Пам’ять всіх святих землі Волинської.

4 Пн. Мч. Юліана Тарсійського. Сщмч. Терентія. Прп. Юлія. Мчч. Арчила і Лоарсаба.

5 Вт. Сщмч. Євсевія. Мчч. Зінона і Зіни.

6 Ср. Свт. Германа. Мчч. Євстохія, Гая, Провія, Лолія.

7 Чт. Народження Предтечі і Хрестителя Господнього Іоана. Мчч. Орентія, Фарнакія, Єроса, Фирмоса, Киріака, Лонгина. Прпп. Іова і Феодосія Манявських.

8 Пт. Прмц. Февронії.

9 Сб. Прп. Давида Солунського. Свтт. Іоана і Дионісія.

10 Нд. 4-та по 50-ниці. Прпп. Сампсона, Севіра і Георгія. Прав. Іоанни Мироносиці.

11 Пн. Прпп. Павла лікаря, Ксенофонта. Мчч. безсрр. Кира і Іоанна.

12 Вт. Святих славних першоверховних апостолів Петра і Павла.

13 Ср. Собор 12-ти апостолів. Свт. Софронія.

14 Чт. Безсрр. Кузьми і Дем’яна. Прав. Ангеліни. Прпп. Никодима і Петра.

15 Пт. Покладення чесної ризи Пр. Богородиці у Влахерні. Свт. Фотія Київськ.

16 Сб. Мч. Якінфа. Прп. Анатолія печ.

17 Нд. 5-та по 50-ниці. Отців 5-ти Всесвітніх Соборів. Свт. Андрія, архиєп. Критського. Прп. Марти. Мчч. Феодота і Феодотії.

18 Пн. Прп. Афанасія Афонського. Мцц. Анни та Кирилли. Прп. Сергія.

19 Вт. Прп. Сисоя. Знайд. мощів прав. Юліанії, кн. Ольщансь. Мчч. Марини. Марти.

20 Ср. Прпп. Фоми і Акакія. Мчч. Перегрина, Лукіана, Помпея, Ісихія і Германа.

21 Чт. Вмч. Прокопія. Прав. Прокопія.

22 Пт. Сщмчч. Панкратія і Кирила. Прмчч. Патермуфія, Копрія і Олександра.

23 Сб. Мчч. Леонтія, Антонія, Даниїла, Антонія, Іаникія, Менея.

24 Нд. 6-та по 50-ниці. Св. рівноап. кн. Ольги. Згадування чуда вмц. Євфимії Всехвал. Мч. Киндея.

25 Пн. Мчч. Прокла і Іларія. Прпп. Михаїла, Іоана і Гавриїла.

26 Вт. Собор Арханг. Гавриїла. Прпп. Стефана і Юліана. Мчч. Серапіона і Маркіана.

27 Ср. Ап. з 70-ти: Акіли. Прп. Онисима. Прпп. Стефана, Єлія і Онисима. Мч. Юста.

28 Чт. Рівноап. князя Володимира Великого. Мчч. Кирика, Улити і Авудима.

29 Пт. Сщмч. Афіногена. Мцц. Юлії та Валентини. Мчч. Антиоха і Павла.

30 Сб. Вмц. Марини (Маргарити). Прпп. Лазаря і Леоніда.

31 Нд. 7-ма по 50-ниці. Мчч. Омеляна і Якинфа. Прп. Іоана Багатостраждального. Прп. Памви.

Серпень

1 Пн. Прп. Макрини, сестри свт. Василія Великого. Прп. Паїсія Печерськ. Прп. Дия.

2 Вт. Прор. Іллі. Прп. Авраамія Галицьк. Знайдення мощів прмч. Афанасія Берест.

3 Ср. Прор. Єзекіїля. Прпп. Симеона та Йоана. Прпп. Онуфрія і Онисима Печерськ.

4 Чт. Мироносиці рівноап. Марії Магдалини. Сщмч. Фоки.

5 Пт. Почаївської ікони Божої Матері. Мчч. Трофима і Феофила. Сщмч. Аполінарія.

6 Сб. Мц. Христини. Мчч. благ. Кнн. Бориса і Гліба. Прп. Полікарпа.

7 Нд. 8-ма по 50-ниці. Успіння прав. Анни, матері Богородиці. Свв. жінок Олімпіади і Євпраксії.

8 Пн. Сщмчч. Єрмолая, Єрмипа і Єрмократа. Прп. Мойсея Угрина. Прмц. Параскеви.

9 Вт. Вмч. і цілит. Пантелеймона. Прпп. Анфіси, Климента, Наума, Сави, Ангеляра.

10 Ср. Апп. з 70-ти: Прохора, Тимона, Пармена і Никанора. Прп. Мойсея.

11 Чт. Мчч. Калиніка, Євстафія, Михаїла. Мцц. Серафими і Феодотії.

12 Пт. Апп. з 70-ти: Силуана, Кріскента, Сили, Єпенета і Андроніка. Мчч. Іоана.

13 Сб. Прав. Євдокима Каппадокіянина. Мц. Іуліти.

14 Нд. 9-та по 50-ниці. Винесення чесного дерева Животворчого Хреста Господнього. Хрещення Руси-України. Мчч. Маккавеїв. Початок Успенського посту.

15 Пн. Сщмч. Стефана Римського. Блж. Василія. Правв. Никодима, Гамаліїла і Авіва.

16 Вт. Прпп. Ісаакія, Далмата, Косми і Фавста. Мч. Раждена.

17 Ср. Семи отроків Ефеських: Максиміліана, Дионісія, Ямвлиха, Мартиніана та ін.

18 Чт. Мч. Євсигнія. Прав. Нони матері свт. Григорія Богослова. Сщмч. Анфира.

19 Пт. ПРЕОБРАЖЕННЯ ГОСПОДНЄ.

20 Сб. Прмч. Дометія Персянина. Прпп. Пімена і Меркурія. Мч. Ора.

21 Нд. 10-та по 50-ниці. Свтт. Омеляна і Мирона. Прп. Григорія, іконопис. Києво-Печерського.

22 Пн. Ап. Матфія. Мчч. Антонія, Якова, Димитрія, Олексія, Юліана, Маркіана.

23 Вт. Мч. архидиякона Лаврентія. Мчч. Сікста, Фелікисима, Агапія, Романа та ін.

24 Ср. Мч. архидиякона Євпла. Прмчч. Феодора і Василія. Мц. Силуани. Свт. Гая.

25 Чт. Мчч. Фотія, Аникити, Памфила і Капітона. Сщмч. Олександра.

26 Пт. Перенесення мощів прп. Максима Сповідника. Свт. Тихона. Мч. Іполіта.

27 Сб. Прор. Михея. Перенесення мощів прп. Феодосія Печерськ.

28 Нд. 11-та по 50-ниці. УСПІННЯ ПРЕСВЯТОЇ БОГОРОДИЦІ.

29 Пн. Перенесення до Царгорода нерукотворн. образа Господа нашого І. Христа.

30 Вт. Мч. Мирона пресвітера. Прп. Аліпія іконописця. Мчч. Павла, Фірса, Левкія.

31 Ср. Мчч. Флора і Лавра. Прп. Іоана Рильського. Мчч. Єрма і Серапіона.

Вересень

1 Чт. Мч. Андрія Стратилата і з ним 2593-х мучеників. Свт. Питирима. Мц. Фекли.

2 Пт. Прор. Самуїла. Мчч. Мемнона, Севіра і з ними 37 мучеників.

3 Сб. Ап. з 70-ти: Фадея. Мцц. Васси, Феогнія, Агапія.

4 Нд. 12-та по 50-ниці. Мчч. Агафоніка, Боголіпа, Северина, Зотика, Акиндина та ін. Сщмч. Горазда.

5 Пн. Мч. Луппа. Сщмч. Іринея, єп.Ліонськ.

6 Вт. Сщмч. Євтихія. Прп. Арсенія. Свт. Петра. Мч. Тихона. Мц. Сіри. Прп. Георгія.

7 Ср. Перен. мощів ап. Варфоломея. Ап. з 70-ти Тита. Свтт. Васиса, Євлогія і Мини.

8 Чт. Мчч. Адріана та Наталії. Вишгородської ікони Богородиці.

9 Пт. Прп. Пімена Великого. Сщмчч. Кукші та Пімена Печерських. Свт. Осії.

10 Сб. Прп. Мойсея. Собор Отців Печерс. Іова Почаївського.

11 Нд. 13-та по 50-ниці. Усікновення голови Іоана Предтечі. День пісний.

12 Пн. Свтт. Олександра, Іоана і Павла. Прпп. Христофора, Фантина і Никодима.

13 Вт. Положення чесного пояса Пр. Богородиці. Сщмч. Кипріана. Свт. Іоана.

14 Ср. Прп. Симеона Стовпн. Прав. Ісуса Навина. Початок церковн. року-індикту.

15 Чт. Мчч. Маманта, Феодота і Руфими. Прпп. Антонія і Феодосія Печерських.

16 Пт. Сщмч. Анфима, єп. Нікомидійського, Мчч. Феофіла, Домни, Дорпофея.

17 Сб. Сщмч. Вавіли, єп. Великої Антиохії. Свт. Іосафа Білгородськ.

18 Нд. 14-та по 50-ниці. Прор. Захарії та прав. Єлисавети. Мцц. Раїси і Фивеї. Мчч. Авида і Урвана.

19 Пн. Спомин про чудо Архистратига Михаїла в Колосах. Прп. Архипа.

20 Вт. Мч. Созонта. Прмч. Макарія Канівського. Апп. Євода і Онисифора.

21 Ср. РІЗДВО ПРЕСВЯТОЇ БОГОРОДИЦІ. Ікони Софії (Київської)

22 Чт. Правв. Іоакима й Анни. Прп. Йосифа. Свт. Феодосія Чернігівського.

23 Пт. Апп. Апелія, Лукія, Климента. Прп. Павла.

24 Сб. Перед Воздвиженням. Мч. Димитрія. Прп. Силуана.

25 Нд. 15-та по 50-ниці. Перед Воздвиженням. Сщмч. Автонома, єп. Італ. Мч. Феодора Олександрійського. Сщмч. Корнута.

26 Пн. Пам’ять оновл. храму Воскресіння Христового в Єрусалимі. Сщмч. Корнилія.

27 Вт. ВОЗДВИЖЕННЯ ЧЕСНОГО І ЖИВОТВОРЧОГО ХРЕСТА ГОСПОДНЬОГО. Строгий піст.

28 Ср. Вмч. Микити. Свт. Акакія. Мчч. Порфирія, Максима. Конч. свт. Іоана Золот.

29 Чт. Мцц. Мелітини, Севастіани і Людмили, кн. Чеської. Вмц. Євфимії.

30 Пт. Мцц. Віри, Надії, Любові та матері їх Софії. Мч. Ілії.

Жовтень

1 Сб. Після Воздвиження. Прп. Євменія, єп. Гортинського.

2 Нд. 16-та 50-ниці. Після Воздвиження. Мчч. Трофима, Доримедонта. Блгв. кн. Ігоря. Мчч. Трофима і Саватія.

3 Пн. Вмч. Євстафія. Мчч. Михаїла і Феодора Черніг.

4 Вт. Ап. з 70-ти: Кандрата. Свт. Димитрія Ростовського. Прпп. Даниїла та Йосифа.

5 Ср. Проп. Іони. Сщмч. Фоки, єп. Синопського. Прп. Іони. Прав. Петра.

6 Чт. Зачаття пророка Іоана Хрестителя. Мц. Іраїди. Св. Артура. Прп. Ксанфипи.

7 Пт. Прмц. Фекли. Св. Владислава.

8 Сб. Поминання жертв голодомору і Чорнобиля. Прп. Євфросинії Олекс. Кончина прп. Сергія Радонезького.

9 Нд. 17-та по 50-ниці. Кончина ап. Іоана Богослова. Свт. Тихона.

10 Пн. Апп. з 70-ти: Марка, Аристарха і Зіни. Мч. Калістрата. Мц. Єпихарії.

11 Вт. Харитона Сповідн. Собор Києво-Печерських святих, які у Ближн. Печ.

12 Ср. Прп. Киріака самітника. Мчч. Дади, Каздої і Гаведдая.

13 Чт. Сщмч. Григорія, просвітителя Великої Вірменії. Свт. Михаїла Київського.

14 Пт. Покрова Пресвятої Богородиці. Прп. Романа. Ап. Ананії.

15 Сб. Сщмч. Кипріана. Мц. Юстини. Св. Андрія. Мч. Феоктиста.

16 Нд. 18-та по 50-ниці. Сщмчч. Дионисія Ареопагіта, Рустика пресвіт, Єливферія. Прп. Дионисія.

17 Пн. Сщмч. Єрофея, єп. Афінського. Прпп. Аммона, Єладія і Онисима Печерських.

18 Вт. Мц. Харитини. Прпп. Єремії і Матвія Печерсь. Прп. Даміана. Сщмч. Дионисія.

19 Ср. Ап. Фоми.

20 Чт. Мчч. Сергія та Вакха. Прп. Сергія печ. Мчч. Юліана, Поліхронія і Кисарія.

21 Пт. Прпп. Досифея і Трифона. Прпп. Пелагії і Таїсії.

22 Сб. Ап. Якова Алфеєва. Прав. Авраама і Лота. Прп. Петра.

23 Нд. 19-та по 50-ниці. Мчч. Євлампія і Євлампії. Собор Волинських святих. Свт. Амфілохія.

24 Пн. Ап. Пилипа. Прп. Феофана. Мцц. Зінаїди і Филоніли.

25 Вт. Мчч. Прова, Тараха і Андроніка. Прп. Косми. Мц. Домники. Свт. Мартина.

26 Ср. Мчч. Карпа, Папіли і Агафодора. Прпп. Веніаміна і Микити. Мц. Агафоніки.

27 Чт. Мчч. Назарія, Гервасія, Протасія і Келсія. Прп. Миколи. Прп. Параскеви Сербської.

28 Пт. Прп. Євфимія Нового. Сщмч. Лукіана Печерського. Свт. Савина.

29 Сб. Мч. Лонгина сотн.

30 Нд. 20-та по 50-ниці. Святих отців 7-го Всесвітнього Собору. Прор. Осії. Прмч. Андрія Крит. Мчч. Безсрр. Косьми і Даміана. Прав. Лазаря.

31 Пн. Ап. Луки. Прп. Йосифа чудотворця. Мч. Марина. Прп. Юліана.

Листопад

1 Вт. Прор. Іоіля Мч. Іара. Блж. Клеопатри та її сина Іоана. Сщмч. Садока, єп. Перс.

2 Ср. Вмч. Артемія.

3 Чт. Прп. Іларіона Великого. Прп. Іларіона, Києво-Печ. Прпп. Феофила та Якова.

4 Пт. Рівноап. Аверкія. Мчч. Олександра, Іраклія і жон Анни і Глікерії.

5 Сб. Заупокійна. Ап. Якова, брата Господнього. Свт. Ігнатія. Прп. Єлисея.

6 Нд. 21-ша по 50-ниці. Мч. Арефи і з ним 4299-ти мучеників. Прпп. Арефи, Сисоя і Феофила К.-Печ.

7 Пн. Мчч. Маркіана, Мартирія і Анастасія. Прав. Тавіфи. Прп. Мартирія Києво-Печ.

8 Вт. Вмч. Димитрія Солунського. Прп. Феофіла Печ. Мч. Лупа. Прп. Афанасія.

9 Ср. Мч. Нестора Солунського. Прп. Нестора-Літописця Києво-Печ. Мч. Марка.

10 Чт. Мц. Параскеви-П’ятниці. Прп. Іова, ігум. Почаївського. Мч. Терентія.

11 Пт. Прмц. Анастасії. Рим. Прп. Аврамія і бл. Марії. Мчч. Клавдія, Астерія, Неона.

12 Сб. Апп. з 70-ти: Тертія, Марка, Юста і Артема. Сщмч. Зіновія.

13 Нд. 22-га по 50-ниці. Апп. з 70-ти: Стахія, Амплія, Урвана, Наркиса, Апелія і Аристовула.

14 Пн. Безсрр. і чудотворців Кузьми і Дем’яна Асійських. Прп. Феодотії. Мч. Дасія.

15 Вт. Мчч. Афонія, Пигасія, Акендина, Єлпидифора і Анемподиста. Прп. Маркіана.

16 Ср. Мчч. Акепсима, Атика, Агапія, Аіфала, Євдоксія, Катерія. Прп. Анни, кн. Київської.

17 Чт. Прпп. Іоаникія, Меркурія Печ. Сщмчч. Никандра і Єрмія. Свт. Павла (Конюш).

18 Пт. Апп. з 70-ти: Єрма, Ліна, Гайя, Філолога. Мчч. Галактіона та Єпистимії.

19 Сб. Свт. Павла, патр. Царгородського. Прп. Луки Києво-Печер.

20 Нд. 23-тя по 50-ниці. Мчч. Мелітинських: Ієрона, Ісихія, Никандра, Афанасія, Маманта, Феогена.

21 Пн. Собор Архистратига Михаїла та інших сил безтілесних. Архангелів: Гавриїла, Рафаїла, Уриїла, Селафіїла, Ієгидуїла, Варахиїла та Ієремиїла.

22 Вт. Прпп. Феоктисти, Матрони, Онисифора К-Печ. Мчч. Онисифора, Порфирія.

23 Ср. Апп. з 70-ти: Єраста, Олімпа, Родіона, Сосипатра, Куарта, Тертія. Мч. Ореста.

24 Чт. Вмч. Мини. Мчч. Віктора, Вікентія, Стефана. Мц. Стефаниди. Прп. Феодора.

25 Пт. Свт. Іоана Милостивого. Прп. Ніла постника. Прор. Ахії.

26 Сб. Свт. Іоана Золотоус. Мц. Манефи. Мчч. Антоніна, Никифора.

27 Нд. 24-та по 50-ниці. Ап. Пилипа. Свт. Григорія Палами. Прав. Юстиніана і Феодори. Пущення.

28 Пн. Пн. Мчч. Гурія, Авіва, Салмона. Прп. Паісія Величк. Початок Різдвяного Посту.

29 Вт. Ап. Матвія. Прав. Фулвіана.

30 Ср. Свт. Григорія чудотво. Прп. Лазаря іконописця. Мч. Гоброна. Прп. Никона.

Грудень

1 Чт. Мчч. Платона, Романа, Закхея, Варула, Алфея.

2 Пт. Прор. Авдія. Мч. Варлаама. Прпп. Авеніра і Варлаама К-печ. Мчч. Ази, Ілідора.

3 Сб. Свт. Прокла. Мчч. Дасія, Євстафія, Саверія, Ісакія, Нирси.

4 Нд. 25-та по 50-ниці. ВВЕДЕННЯ В ХРАМ ПРЕСВЯТОЇ БОГОРОДИЦІ.

5 Пн. Апп. з 70-ти: Филимона, Архипа. Блгв. Ярополка. Мцц. Апфії, Кикилії.

6 Вт. Свт. Амфилохія. Свт. Григорія. Мчч. Сисинія та Феодора.

7 Ср. Вмц. Катерини. Вмч. Меркурія. Мцц. Августи, Филофеї. Мч. Порфирія.

8 Чт. Сщмчч. Климента, папи Римського і Петра. Прп. Петра мовчальника.

9 Пт. Прпп. Аліпія стовпника і Якова пустельника.

10 Сб. Прпп. Палладія і Романа. Вмч. Якова.

11 Нд. 26-та по 50-ниці. Прмч. Стефана Нового. Мчч. Іринарха, Стефана, Василія, Григорія, Іоана.

12 Пн. Мч. Парамона і з ним 370-и мучеників. Прп. Нектарія. Мч. Филумена.

13 Вт. Ап. Андрія Першозваного. Свт. Фруменія.

14 Ср. Прор. Наума. Прав. Філарета Милостивого. Мч. Ананії.

15 Чт. Прор. Авакума. Прп. Афанасія Києво-Печ. Мц. Миронії. Прпп. Іоана, Іраклимона.

16 Пт. Прор. Софонії. Прпп. Сави, Феодула та Іоана. Сщмч. Феодора.

17 Сб. Вмц. Варвари. Мц. Юліанії. Прп. Іоана Дамаського.

18 Нд. 27-ма по 50-ниці. Прп. Сави Освяченого. Свт. Гурія. Мч. Анастасія. Прп. Киріона.

19 Пн. Свт. Миколая, архиєп. Мир. Лікійських. Свт. Максима, митр. Київського.

20 Вт. Свт. Амвросія, Медіоланськ. Прп. Ніла Столобен. Прпп. Антонія, Іоана К-Печ.

21 Ср. Апп. з 70-ти: Сосфена, Кифи, Аполлоса, Тихіка, Єпафродита, Кисарія, Онисифора.

22 Чт. Зачаття прав. Анною Пресвятої Богородиці. Прор. Самуїла. Свт. Софронія.

23 Пт. Мчч. Мини, Єрмогена і Євграфа. Свт. Іосафа Білгородського. Прп. Фоми. Блаж. Ангеліни.

24 Сб. Прп. Даниїла Стовпника. Прп. Никона.

25 Нд. 28-ма по 50-ниці. Святих праотців. Свт. Спиридона чудотворця. Прп. Ферапонта. Сщмч. Олександра.

26 Пн. Мчч. Євстратія, Євгенія, Ореста та ін. Прп. Аркадія. Прп. Мардарія К-Печер.

27 Вт. Мчч. Фірса, Левкія, Аріана, Калиника, Феотиха, Аполлонія, Филимона та ін.

28 Ср. Сщмч. Єлевферія. Собор Кримських святих. Прпп. Павла, Трифона і Парда.

29 Чт. Прор. Агея. Мч. Марина. Блаж. Феофанія.

30 Пт. Прор. Даниїла і трьох отроків: Ананії, Азарії та Мисаїла.

31 Сб. Перед Різдвом. Мчч. Севастіана, Заї, Касторія, Маркеліна.

Читайте новини «МБ» у Facebook | Telegram | Viber | Instagram

Учора, 11:10

0 2 816

Эктодомен гликопротеина из вакцинного штамма кандидата № 1 вируса мачупо, вызванного вирусом хунина, частично ослабленный у мышей, лишенных рецептора IFN-αβ / γ

Abstract

Вирус Мачупо (MACV), аренавирус Нового Света, является этиологическим агентом боливийской геморрагической лихорадки (BHF). Вирус Хунина (JUNV), близкий родственник, вызывает аргентинскую геморрагическую лихорадку (AHF). Ранее мы сообщали, что рекомбинантный химерный MACV (rMACV / Cd # 1-GPC), экспрессирующий гликопротеин из вакцинного штамма Candid # 1 (Cd # 1) JUNV, полностью ослаблен в мышиной модели и защищает животных от летального заражения MACV. .RMACV с единственной заменой F438I в трансмембранном домене (TMD) GPC, который эквивалентен аттенуирующей мутации F427I в Cd # 1 GPC, был аттенуирован на мышиной модели, но генетически нестабилен. Кроме того, одной мутации TMD было недостаточно для полного ослабления JUNV, что указывает на то, что другие домены GPC также могут вносить вклад в ослабление. Чтобы исследовать потребность в различных доменах Cd # 1 GPC для успешного ослабления MACV, мы спасли несколько rMACV, экспрессирующих эктодомен GPC, от Cd # 1 либо отдельно (MCg1) вместе с заменой TMD F438I (MCg2), либо с TMD Cd # 1 (MCg3).Все rMACV демонстрировали сходные кривые роста в культивируемых клетках. У мышей MCg1 показал значительное снижение летальности по сравнению с rMACV. MCg1 был обнаружен в мозге и селезенках мышей, инфицированных MCg1, и инфекция была связана с воспалением тканей. С другой стороны, все животные пережили инфекцию MCg2 и MCg3 без обнаруживаемых уровней вируса в различных органах, при этом продуцируя нейтрализующие антитела против Cd # 1. В целом наши данные предполагают незаменимую роль каждого домена GPC в полной аттенуации и иммуногенности rMACV / Cd # 1 GPC.

Сведения об авторе

Вирус

Machupo (MACV), член семейства Arenaviridae , вызывает у людей боливийскую геморрагическую лихорадку (BHF). На сегодняшний день нет одобренной вакцины или лечения, несмотря на высокий уровень летальности от BHF. rMACV / Cd # 1-GPC полностью аттенуирован и защищает мышей от смертельного заражения MACV. Хотя одна детерминанта вирулентности была обнаружена в трансмембранном домене GPC (F438), другие детерминанты вирулентности в GPC весьма вероятны. Наши новые данные показали, что эктодомен Cd # 1 GPC необходим, но недостаточен для полного ослабления rMACV / Cd # 1-GPC. Это новое открытие может помочь создать сильно аттенуированные MACV для разработки вакцины и / или для целей скрининга лекарств.

Образец цитирования: Koma T, Huang C, Aronson JF, Walker AG, Miller M, Smith JN, et al. (2016) Эктодомен гликопротеина из вакцинного штамма Candid # 1 вируса мачупо, вызванного вирусом хунина, частично ослаблен у мышей, лишенных рецептора IFN-αβ / γ. PLoS Negl Trop Dis 10 (8): e0004969. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004969

Редактор: Грегори Д.Эбель, Университет штата Колорадо, США

Поступила: 28 апреля 2016 г .; Принята к печати: 10 августа 2016 г .; Опубликован: 31 августа 2016 г.

Авторские права: © 2016 Koma et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все файлы последовательностей доступны в DDBJ / EMBL / GenBank (инвентарный номер: LC123592, LC123593 и LC123594).Данные последовательности также доступны в файле S1.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантом Службы общественного здравоохранения R01AI093445 / Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний / Национальными институтами здравоохранения в СП (https://www.niaid.nih.gov/researchfunding/grant/ Pages / default.aspx). ТЗ была частично поддержана стипендией JSPS для научных исследований за рубежом / Японским обществом содействия науке (https://www.jsps.go.jp/). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Вирус Мачупо (MACV) из клады B аренавирусов Нового Света семейства Arenaviridae является этиологическим агентом Боливийской геморрагической лихорадки (BHF) [1]. Несколько аренавирусов Нового Света клады B, включая MACV, вирус Хунина (JUNV), вирус Гуанарито, вирус Сабиа и вирус Чапаре, вызывают геморрагическую лихорадку у людей в Южной Америке [2–4].Клинические симптомы BHF аналогичны симптомам аргентинской геморрагической лихорадки (AHF), вызванной JUNV. И MACV, и JUNV были объявлены избранными агентами Министерством здравоохранения и социальных служб США, и для исследований с этими агентами требуется объект уровня биобезопасности 4 (BSL4) в США. Летальность от BHF составляет от 25 до 35% [5,6], и нет одобренных методов лечения или вакцинации. Среди патогенных аренавирусов человека только живой аттенуированный штамм Candid # 1 (Cd # 1) JUNV доступен в качестве вакцины для человека против ОСН в Аргентине [7,8].

Аренавирусы — это двусегментированные вирусы с отрицательной РНК [1]. Геномная РНК L-сегмента вируса кодирует вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу (L-белок) и белок цинкового пальца (Z). Сегмент S кодирует нуклеопротеин (NP) и предшественник гликопротеина (GPC) [1]. GPC первоначально синтезируется как единый полипептид и расщепляется на стабильный сигнальный пептид (SSP) и комплекс GP1 / GP2 сигнальной пептидазой хозяина. Комплекс GP1 / GP2 далее расщепляется на субъединицы GP1 и GP2 хозяйской субтилазой SKI-1 / S1P [9,10].Субъединица GP1 составляет часть эктодомена GPC и связывается с рецептором. Патогенные аренавирусы Нового Света из Clade B используют человеческий рецептор трансферрина 1 (hTfR1) в качестве рецептора [11,12], тогда как аренавирусы Старого Света и аренавирусы Clade C Нового Света используют альфа-дистрогликан (α-DG) [13,14] . Субъединица GP2 содержит оставшуюся часть эктодомена, трансмембранный домен (TMD) и цитоплазматический хвост (CT) [1,10] (S1 фиг.).

Ранее мы обнаружили, что GPC вакцинного штамма JUNV Cd # 1 превращал патогенный штамм JUNV и MACV в полностью аттенуированный in vivo [15,16].Последовательности TMD GPC высоко консервативны между MACV и JUNV и имеют решающее значение для вирулентности этих патогенных аренавирусов Нового Света. Альбарино К.Г. и др. . и мы определили, что одиночная замена F427I в TMD JUNV GPC приводит к ослаблению JUNV у мышей-сосунков после внутричерепной инокуляции [17] и у морских свинок после периферической инокуляции [15], соответственно. Одной мутации, по-видимому, недостаточно для полного ослабления JUNV, поскольку на модели мышей-сосунков все еще наблюдается 10% летальность [17], а у морских свинок выявлены легкие проявления заболеваний и распространение вируса [15].Для MACV эквивалентная замена F438I в GP2 TMD также ослабляет MACV у мышей IFN-αβ / γ R — / — . Однако мутантный MACV генетически нестабилен, и реверсия к вирусу дикого типа была идентифицирована [18]. Все эти данные в совокупности указывают на то, что, хотя TMD важен для вирулентности, другие домены GPC также могут быть важны. Сравнение последовательностей вакцинного штамма Cd # 1 с патогенными штаммами JUNV показало несколько мутаций в области эктодомена GPC [17] (S1 фиг.).Соответственно, мы спасли rMACV с заменой эктодомена MACV GPC его аналогом Cd # 1 либо отдельно (MCg1), либо в сочетании с мутацией TMD F427I (MCg2) или с TMD Cd # 1 (F427I и I431V) (рис. 1A и S1 фиг.) И охарактеризовали их репликацию in vitro и in vivo .

Рис. 1. Схематические диаграммы и кривая роста MCg1, MCg2 и MCg3.

(A) Эктодомен только GPC rMACV был заменен аналогом Cd # 1 в основной цепи rMACV (MCg1), эктодомен rMACV был заменен на эктодомен Cd # 1 GPC с мутацией F427I TMD (MCg2), а эктодомен и TMD rMACV GPC были заменены таковыми из Cd # 1 GPC (MCg3).(B) Кривую роста MCg1, MCg2 и MCg3 определяли в клетках Vero (rMACV: N = 3, rCd # 1: N = 4, MCg1-3: N = 7). Титр вируса MCg1 был значительно выше, чем титр rCd # 1, MCg2 и MCg3 при 48 hpi в клетках Vero (**, P <0,01, однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Даннета для MCg1 по сравнению с rCd # 1, MCg1 против MCg2 и MCg1 против MCg3). (C) Кривая роста MCg1, MCg2 и MCg3 была определена в клетках A549 (rMACV: N = 3, rCd # 1: N = 4, MCg1-3: N = 6). Вирусный титр MCg1 был значительно выше, чем титр rCd # 1, MCg2 и MCg3 при 72 и 96 hpi в клетках A549 (**, P <0. 01, односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом Даннета для MCg1 по сравнению с rCd # 1, MCg1 по сравнению с MCg2 и MCg1 по сравнению с MCg3). Пунктирными линиями обозначен предел обнаружения. Данные rCd # 1 на Рис. 1B и 1C были опубликованы на Рис. 1B и 1C соответственно, из [16].

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004969.g001

Методы

Клетки и вирусы

клетки Vero почки африканской зеленой мартышки (ATCC, CCL-81) и клетки почки детеныша хомячка (BHK-21) (ATCC, CCL-10) поддерживали в минимальной эссенциальной среде (MEM) (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) с добавлением 10% FBS (Life Technologies) и 1% пенициллин-стрептомицин (Life Technologies).Клетки линии альвеолярных эпителиальных клеток человека A549 (ATCC, CCL-185) поддерживали в среде Ham’s F-12K (Life Technologies), содержащей 10% FBS (Life Technologies) и 1% пенициллин-стрептомицин (Life Technologies). Рекомбинантный штамм MACV Carvallo (rMACV) [19], рекомбинантный Cd # 1 (rCd # 1) [20] и MCg1, MCg2 и MCg3 были сконструированы и затем спасены с помощью плазмидной трансфекции, описанной ранее. Мы использовали вирусы первого пассажа для всех экспериментов по заражению в этом исследовании.

Исследования на животных

IFN-αβ / γ R — / — мышей (мышей штамма 129 дважды подвергали обратному скрещиванию с мышами C57BL / 6) разводили и содержали в помещениях ABSL-2 в Галвестонской национальной лаборатории (GNL) Медицинского университета Техаса. Филиал в Галвестоне.Параллельно выполняемые контроли rMACV и rCd # 1 были описаны ранее [16]. Всем животным имплантировали транспондеры (чипы) BMDS IPTT-300, полученные от Bio Medic Data Systems, Inc. (Сифорд, Делавэр), за 4-7 дней до заражения, как описано ранее [21]. Чипы сканировались в указанные дни. Чтобы определить, приводит ли замена Cd # 1 GPC эктодоменом к ослаблению rMACV, мышей IFN-αβ / γ R — / — в возрасте от восьми до 15 недель заражали внутрибрюшинной инъекцией rMACV, rCd # 1, MCg1, MCg2 или MCg3 (10000 БОЕ) и контролировались в течение 42 дней после заражения (dpi).Эксперименты на животных проводили дважды в независимых исследованиях. Для оценки распространения вируса у инфицированных животных трех животных в группе умерщвляли с разрешением 17 dpi, поскольку у мышей, инфицированных MCg1, симптомы начинались с 17 dpi. Образцы сыворотки, головного мозга, селезенки и печени были собраны для титрования вирусов и ELISA на IgG, когда животные были умерщвлены или умерли. Животных гуманно усыпляли в конце исследования (42 точки на дюйм) или если они становились парализованными или теряли более 20% веса тела и / или если температура тела опускалась ниже 34 ° C.

Конструкция сегментов S для MCg1, MCg2 и MCg3

S-сегменты MCg1, MCg2 и MCg3, замененные эктодоменом Cd # 1 GPC, были получены с помощью ПЦР из трех ампликонов ПЦР. Последовательности праймеров перечислены в таблице 1. После расщепления с помощью AvrII и очистки в геле ДНК сегментов S вставляли в управляемую РНК pol I экспрессионную плазмиду pRF42 в антигеномной ориентации [19,20]. Данные вирусного секвенирования для S-сегмента MCg1, MCg2 и MCg3 были депонированы в DDBJ / EMBL / GenBank (номер доступа: LC123592, LC123593 и LC123594 соответственно).

Заявление об этике

Все исследования на животных проводились в учреждениях, аккредитованных Международной ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторных животных (AAALAC International) в соответствии с Законом о благополучии животных, руководящими принципами NIH и федеральным законом США. Комитет по институциональному уходу и использованию животных Медицинского отделения Техасского университета в Галвестоне одобрил протокол исследования (1208050A).

Все рекомбинантные ДНК и вирусы были созданы после утверждения Уведомления об использовании Институциональным комитетом по биобезопасности Медицинского отделения Техасского университета в Галвестоне.Эксперименты с rMACV, rCd # 1, MCg1, MCg2 и MCg3 были выполнены в лабораториях BSL-4 в GNL в соответствии с институциональными руководящими принципами безопасности, руководящими принципами NIH и федеральным законом США.

Кривая роста и серийный проход

Кривую роста вируса определяли путем измерения титров инфекционных вирусов в супернатантах клеток Vero и клеток A549, инфицированных вирусами, при множественности инфицирования (MOI) 0,01 в течение 96 часов после инфицирования (hpi). Чтобы исследовать генетическую стабильность MCg1, MCg2 и MCg3, вирусы были последовательно пассированы в клетках Vero в двух экземплярах, как описано ранее [16,18]. Последовательный пассаж был выполнен при предполагаемой MOI равной 0.01 на основе рис. 1B каждые 2 или 3 дня. Титр вируса измеряли с помощью анализа бляшек на клетках Vero, как описано ранее с небольшими модификациями [20,22]. Образцы супернатанта или сыворотки серийно разбавляли средой MEM, содержащей 2% FBS, и инкубировали на монослоях клеток Vero в 12-луночных планшетах в течение 1 часа при 37 ° C. Затем супернатант заменяли на 0,6% -ный слой трагаканта (в среде MEM, содержащей 2% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин) и инкубировали в течение 7-8 дней при 37 ° C. Бляшки фиксировали и окрашивали 1% кристаллическим фиолетовым в 10% формалине.

Измерение вирус-специфического титра IgG с помощью ELISA

клеток Vero инфицировали rCd # 1 или rMACV при MOI = 0,1 и собирали при 72 dpi. Инфицированные и неинфицированные клетки лизировали буфером для лизиса клеток (50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 300 мМ NaCl, 0,5% Triton X-100, 0,5% коктейль ингибиторов протеазы [Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури]). на льду 2 ч 30 мин. Супернатанты использовали в качестве антигенов для ELISA. Планшет для ELISA покрывали лизатами клеток, разведенными 1: 5, в течение ночи при 4 ° C.После трехкратной промывки буфером PBS, содержащим 0,05% твин 20 (PBS-T), лунки блокировали PBS-T, содержащим 5% бычий сывороточный альбумин, в течение 1 ч при 37 ° C, а затем инкубировали с образцами сыворотки, разведенными 1: 100. в течение 1 ч при 37 ° C. После промывания добавляли меченные пероксидазой хрена козьи антитела против IgG мыши (Southern Biotechnology, Бирмингем, Алабама) в качестве вторичных антител. Цветные реакции проявляли с использованием или -фенилендиамина дигидрохлорида (OPD) (Sigma-Aldrich) в течение 20 минут.Поглощение измеряли при 450 нм с использованием ридера VersaMax ELISA (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния). Значение оптической плотности (OD), измеренное для лизатов неинфицированных клеток, вычитали из значения OD лизатов инфицированных клеток. Сыворотки 18 и 16 неинфицированных мышей использовали в качестве отрицательного контроля для rCd # 1 и rMACV-специфических IgG ELISA, соответственно. Пороговое значение для положительного результата было определено как 5-кратное значение стандартного отклонения отрицательного контроля.

Тест нейтрализации уменьшения зубного налета

Тест нейтрализации уменьшения бляшек (PRNT) был проведен для обнаружения нейтрализующих антител против rMACV и rCd # 1, как описано ранее [15].Образцы инактивированной нагреванием сыворотки или среды серийно разводили и инкубировали с 80 БОЕ rMACV или rCd # 1 в течение 1 ч при 37 ° C. Титры инфекционных вирусов получали на клетках Vero с помощью анализа бляшек, как описано выше. Титры PRNT 50 были представлены как наибольшее разведение сыворотки, которое привело к 50% снижению числа бляшек.

Экстракция РНК и анализ последовательности

РНК

экстрагировали из органов или клеток с использованием реагента Trizol (Life Technologies) и набора Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research, Irvine, CA), как описано ранее [16].Обратную транскрипцию проводили с использованием системы синтеза первой цепи Superscript III (Life Technologies) и случайных праймеров в соответствии с протоколом производителя. кДНК амплифицировали с помощью ПЦР на два и три фрагмента ДНК для вирусных S и L сегментов соответственно. Продукты ПЦР очищали с использованием набора для очистки QIAquick PCR (Qiagen) и напрямую секвенировали с использованием секвенатора ДНК ABI Prism 3130xl (Life Technologies). Для определения 5 ’и 3’ UTR сегментов S и L использовали 5 ’RACE-систему для быстрой амплификации концов кДНК и 3’ RACE-систему для быстрой амплификации концов кДНК, соответственно (Life Technologies).

Гистопатология

Ткани собирали у умерщвленных или мертвых животных и фиксировали в 10% забуференном формалине в течение не менее 5 дней. Затем ткани были обрезаны и залиты парафином. Тонкие срезы органов (5,0 мкм) окрашивали гематоксилином и эозином.

Статистический анализ

Данные были проанализированы с использованием апостериорного критерия Даннета после однофакторного дисперсионного анализа, анализа логарифмических рангов и U-критерия Манна-Уитни. Результаты были представлены как статистически разные, когда значение P было <0. 05.

Результаты

Замена эктодомена GPC не повлияла на рост rMACV

MCg1, содержащий эктодомен Cd # 1, MCg2, содержащий эктодомен Cd # 1 и мутацию F427I TMD, и MCg3, содержащий эктодомен и TMD Cd # 1, были сконструированы и затем спасены трансфекцией плазмиды (рис. S1 Рис). Остаток 3 rd GP2 TMD, который связан с вирулентностью, представляет собой F438 в MACV, F427 в MCg1 и I427 в MCg2, MCg3 и Cd # 1.Рост вируса MCg1 в клетках Vero, полученных из почек африканских зеленых мартышек, линии клеток с дефицитом IFN I типа, был сопоставим с ростом вируса rMACV, в то время как титры rCd # 1, MCg2 и MCg3 были ниже, чем титры MCg1 на 48. hpi (рис. 1B). Подобные результаты наблюдались в человеческих альвеолярных эпителиальных клетках A549 (рис. 1C). Кинетика роста MCg1 была сравнима с таковой для rMACV, а титр был выше, чем у rCd # 1, MCg2 и MCg3 при 72 и 96 hpi. Эти результаты показали, что замена эктодомена rMACV GPC на Cd # 1 существенно не изменила рост вируса.

Для оценки стабильности последовательностей TMD в MCg2 и MCg3 эти вирусы были серийно пассированы 5 раз в клетках Vero. Никаких реверсий или дополнительных адаптивных мутаций не было обнаружено ни в одном вирусном геноме после 5 пассажей клеточной культуры.

Замена эктодомена rMACV GPC на аналог из визуализированного вируса Cd # 1, аттенуированный

Для оценки их патогенности на нашей установленной летальной мышиной модели MACV, MCg1, MCg2 и MCg3 были внутрибрюшинно инокулированы мышам IFN-αβ / γ R — / — .Как и ожидалось, все животные, инфицированные rMACV, умерли от инфекции или достигли гуманной конечной точки исследования на 35 dpi, о чем также сообщалось в предыдущем исследовании [16]. Однако только 3 из семи мышей скончались от инфекции MCg1 при 33 dpi (рис. 2A). Выживаемость группы, инфицированной MCg1, была значительно увеличена по сравнению с группой, инфицированной rMACV ( P < 0,01, тест логарифмического ранга). У всех животных, инфицированных rMACV, развились такие проявления болезни, как неряшливая шерсть и сутулость, при разрешении 11–15 точек на дюйм, как описано в ранее опубликованной работе [16]. С другой стороны, появление симптомов у животных, инфицированных MCg1, задерживалось в среднем на 7,6 дней (диапазон 2–12 дней) (рис. 2B). Аналогичная тенденция наблюдалась и в изменении массы тела. Потеря веса более 5% впервые наблюдалась при среднем значении 13,7 точек на дюйм (диапазон 10–18 точек на дюйм) у животных, инфицированных rMACV, и в среднем 22,2 точек на дюйм (диапазон значений 15–31 точек на дюйм) у животных, инфицированных MCg1 (рис. 2С). Гипотермия и дисбаланс были показаны только у мышей, инфицированных rMACV, за 1-3 дня до смерти (рис. 2D). С другой стороны, ни одно из животных, инфицированных rCd # 1, MCg2 и MCg3, не погибло от инфекции.Только у двух из 7 животных, инфицированных MCg2, наблюдались легкие симптомы, такие как легкая неряшливая шерсть при 26 dpi в течение 3 дней. Однако потери массы тела и других симптомов не наблюдалось у инфицированных MCg2, а также у животных, инфицированных rCd # 1 и MCg3. Эти данные показывают, что эктодомен Cd # 1 GPC в сочетании с мутацией TMD приводил к более сильному ослаблению, чем только эктодомен Cd # 1.

Рис. 2. IFN-αβ / γ R — / — мышей инфицировали 10 000 БОЕ rMACV, rCd # 1, MCg1, MCg2 и MCg3 внутрибрюшинным путем.

(A) Выживаемость мышей IFN-αβ / γ R — / — после инфекций rMACV, rCd # 1, MCg1, MCg2 и MCg3 (N = 7 на группу, кроме rCd # 1, для которых N = 6 ). Статистически значимые различия между группами, инфицированными rMACV и MCg3, указаны звездочками (**, P < 0,01 по логарифмическому ранговому критерию). Выживаемость группы, инфицированной MCg1, была значительно увеличена (**, P < 0,01 для группы, инфицированной rMACV, по сравнению с группой, инфицированной MCg1). Существенной разницы между группами, инфицированными MCg1 и MCg3, не наблюдалось ( P = 0.06). (B) Клинические симптомы контролировались ежедневно. У всех животных, инфицированных rMACV, наблюдались такие заболевания, как неряшливая шерсть и сутулость при разрешении 11–15 точек на дюйм, в то время как у животных, инфицированных MCg1, симптомы проявлялись с задержкой на 2–12 дней. У двух мышей, инфицированных MCg2, наблюдалась легкая неряшливая шерсть при разрешении от 26 до 28 точек на дюйм. (C) Изменения массы тела отслеживали в указанные дни. Планки погрешностей указывают на SEM (N = 7 на группу, кроме rCd # 1, для которого N = 6). Потеря 5% массы тела у мышей, инфицированных MCg1, была отложена на 6-13 дней, чем в группе rMACV.(D) В указанные дни контролировали температуру тела. В то время как шесть из семи животных, инфицированных rMACV, демонстрировали гипотермию (ниже 34 ° C) за 1-3 дня до смерти, в группах животных, инфицированных rCd # 1, MCg1, MCg2 и MCg3, гипотермии не наблюдалось. Пунктирная линия указывает на 34 ° C. RMACV и rCd # 1 инокулировали мышам IFN-αβ / γ R — / — в качестве положительного контроля и отрицательного контроля, соответственно, одновременно с MCg1, MCg2 и MCg3. Данные rMACV и rCd # 1 на рис. 2A, 2C и 2D были опубликованы на рис. 2A, 2B и 2C соответственно [16].

https://doi.org/10.1371/journal.pntd. 0004969.g002

В мышиной модели IFN-αβ / γ R — / — rMACV распространяется системно и проникает в ЦНС инфицированных мышей [16,19] . Поскольку MCg1 был до некоторой степени ослаблен в зависимости от проявлений заболеваний на мышиной модели, мы исследовали распространение MCg1 в мозг, печень, селезенку и его присутствие в сыворотке (рис. 3A). В то время как rMACV был обнаружен в образцах головного мозга, селезенки, печени и сыворотки всех мышей на терминальной стадии (от 24 dpi до 35 dpi), как показано в наших ранее опубликованных данных [16], MCg1 был обнаружен в некоторых из головного мозга (4 из 7 мышей с разрешением 33 и 42 точек на дюйм), селезенки (3 из 7 мышей с разрешением 33 и 42 точек на дюйм) и образцы сыворотки (1 из 3 мышей с разрешением 17 точек на дюйм) (рис. 3A).По сравнению с ранее опубликованными данными rMACV [16], средний титр MCg1 (в 4 положительных случаях) в головном мозге был в 340 раз ниже при 33 dpi или 42 dpi, чем у животных, инфицированных rMACV на терминальной стадии (от 24 dpi до 35 точек на дюйм). Средний титр в селезенке был сопоставим у животных, инфицированных rMACV и MCg1. Титры в печени животных, инфицированных MCg1, были ниже предела обнаружения. Эти результаты предполагают ограниченную способность MCg1 к распространению по сравнению с rMACV. Инфекционный вирус не был обнаружен в органах и сыворотках животных, инфицированных rCd # 1, MCg2 и MCg3 (рис. 3A) [16].В целом, эти данные подтверждают гипотезу о том, что замена эктодомена MACV GPC привела к значительному нарушению распространения вирусов в мозг и печень.

Рис. 3. Титры вирусов в органах и индукция rCd # 1-специфических IgG после инфицирования.

(A) Титр вируса был определен в головном мозге, селезенке и сыворотке для MCg1, MCg2 и MCg3. Пунктирная линия указывает минимальный предел обнаружения. (B) ELISA-измерение IgG было выполнено для выявления иммунного ответа у мышей после заражения.Значение OD, полученное для лизатов неинфицированных клеток, использовали в качестве отрицательного контроля для лизатов клеток и вычитали из значения OD лизатов инфицированных клеток. Все протестированные образцы, за исключением двух образцов, собранных с разрешением 17 dpi (из группы, инфицированной MCg3, и группы, инфицированной rCd # 1), были положительными. Планки ошибок указывают на SEM (N = 3 для 17 точек на дюйм и N = 5 для 33/42 точек на дюйм или 42 точек на дюйм). Данные rMACV и rCd # 1 на рис. 3B опубликованы на рис. 2E из [16].

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pntd.0004969.g003

Для оценки гуморального иммунного ответа хозяина у инфицированных животных проводили непрямой иммуноферментный анализ IgG с использованием лизатов, приготовленных из инфицированных вирусом клеток. Все протестированные образцы были IgG-положительными как для rCd # 1, так и для rMACV, за исключением одного от MCg3-инфицированного животного при 17 dpi и одного от rCd # 1-инфицированного животного при 17 dpi (фиг. 3B и S2, фиг.). Уровни противовирусного IgG были сравнимы в образцах сыворотки от животных, инфицированных MCg1, MCg2 и MCg3, что указывает на то, что MCg2 и MCg3 вызывают такие же уровни иммунных ответов, как и MCg1, хотя вирусы не обнаруживаются в органах животных, инфицированных MCg2 и MCg3. Поскольку почти все животные продуцировали антитела против rCd # 1 и rMACV на основании ELISA, титры нейтрализующих антител против rCd # 1 и rMACV определяли с помощью анализа PRNT 50 (таблица 2). Инфекция MCg1 в целом индуцировала высокие уровни нейтрализующих антител против rCd # 1 и относительно низкие уровни нейтрализующих антител против rMACV, предполагая, что антитела против эктодомена Cd # 1 GPC не могли эффективно нейтрализовать MACV. У животных, инфицированных rMACV, уровни нейтрализующих антител против rCd # 1 и rMACV были ниже, чем у мышей, инфицированных MCg1 (таблица 2) [16].У животных, инфицированных MCg2 и MCg3, были обнаружены высокие титры нейтрализующих антител против rCd # 1, но все нейтрализующие антитела против rMACV были ниже уровня обнаружения (таблица 2). Эти данные предполагают неспособность MCg2 и MCg3 вызывать детектируемый нейтрализующий ответ антител против rMACV.

Гистопатологическое исследование было выполнено путем окрашивания залитых парафином срезов гематоксилином и эозином (H&E). В мозге менингит и периваскулярные наручники часто выявлялись у мышей, инфицированных MCg1, и мышей, инфицированных rMACV, но не у мышей, инфицированных rCd # 1, MCg2 и MCg3 (рис. 4, рис. S3 и таблица 3).Очаговое воспаление и перипортальные инфильтраты в печени наблюдались у некоторых животных, инфицированных MCg1, и у большинства животных, инфицированных rMACV. У одной из инфицированных MCg2 мышей развились легкие симптомы (рис. 2В) и было небольшое очаговое воспаление в 2 отделах печени. Микровезикулярный стеатоз печени часто наблюдался только у животных, инфицированных rMACV. Реактивная гиперплазия белой пульпы была охарактеризована в селезенках некоторых животных, инфицированных MCg1, и большинства животных, инфицированных rMACV. Взятые вместе, инфицирование MCg1, экспрессирующим эктодомен Cd # 1 GPC, вызывало более умеренные гистопатологические изменения по сравнению с rMACV, в то время как MCg2 и MCg3, содержащие дополнительные изменения в TMD, были сильно ослаблены, и никаких повреждений органов не наблюдалось.

Рис. 4. Гистопатологические изменения в головном мозге, селезенке и печени инфицированных мышей при 17 dpi, терминальной стадии и 42 dpi.

Менингит и периваскулярные наручники (стрелка) наблюдались в мозге мышей, инфицированных MCg1, при 17 dpi, на терминальной стадии (33 dpi), в конце исследования (42 dpi) и в мозге мышей, инфицированных rMACV, на конечный этап (24 dpi). Перипортальные инфильтраты или очаговое воспаление присутствовали в печени животных, инфицированных MCg1, с разрешением 17, 33 и 42 точек на дюйм.Перипортальные инфильтраты и микровезикулярный стеатоз (Arrowhead) наблюдались в печени rMACV-инфицированного животного при 24 dpi. Реактивная гиперплазия белой пульпы слегка нарушалась в селезенке MCg1-инфицированного животного при 33 dpi и умеренно в селезенке rMACV-инфицированного животного при 24 dpi. Не наблюдалось значительных гистологических изменений у инфицированных MCg2 и MCg3 животных при 42 dpi. Увеличение: x4 (селезенка), x10 (мозговые оболочки и печень), x20 (сосуды головного мозга) и x40 (вставки).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pntd.0004969.g004

Обсуждение

Для исследования потенциальной роли эктодомена Cd # 1 GPC в ослаблении rMACV / Cd # 1-GPC, rMACV, экспрессирующего только эктодомен Cd # 1 (MCg1) вместе с мутацией F427I TMD (MCg2) или с TMD Cd # 1 (MCg3) были разработаны с использованием системы обратной генетики. Здесь мы впервые показали, что замена эктодомена MACV GPC на эктодомен Cd # 1 делает MACV частично ослабленным по сравнению с rMACV / Cd # 1-GPC, предполагая, что не только эктодомен, но и другие домены в Cd # 1 GPC могут также способствуют более высокому уровню ослабления rMACV / Cd # 1-GPC в модели на животных.Кроме того, rMACV / Cd # 1-GPC, который содержит весь Cd # 1 GPC в основной цепи MACV, был способен индуцировать более высокие уровни анти-rMACV-нейтрализующих антител (средний геометрический титр PRNT, 1: 161) [16], чем MCg1 (среднее геометрическое титр PRNT, 1: 90,9) у инфицированных животных. Этот результат также предполагает, что домены SSP, TMD и CT Cd # 1 GPC могут усиливать индукцию антител, которые нейтрализуют rMACV.

животных, инфицированных MCg1, показали значительное снижение смертности и увеличенное время выживания по сравнению с группой rMACV (рис. 2А).Начало заболевания было отложенным и более мягким у мышей, инфицированных MCg1, чем у животных, инфицированных rMACV (рис. 2B и 2C). Титр вируса MCg1 в мозге и печени был также ниже, чем у rMACV [16] (рис. 3A). В соответствии с этими данными, патологические изменения в печени и селезенке у животных, инфицированных MCg1, были менее серьезными, чем у животных, инфицированных rMACV (рис. 4 и табл. 3). Эти данные показали, что один эктодомен Cd # 1 GPC может частично ослабить MACV, однако другой домен, такой как TMD в Cd # 1 GPC, также необходим для достижения полного ослабления вируса.

Инфекция

MCg1 способна вызывать гуморальный иммунный ответ, о чем свидетельствует продукция вирусоспецифического IgG и нейтрализующих антител против rMACV и rCd # 1 (фиг. 3B, фиг. S2 и таблица 2). Инфекция MCg1 у животных вызвала мощный анти-rMACV-нейтрализующий ответ антител (средний геометрический титр PRNT, 1: 90,9), тогда как инфекция rMACV не вызвала измеримого ответа анти-rMACV-нейтрализующих антител. Интересно, что оба вируса индуцировали аналогичные уровни rMACV-специфических IgG, как измерено с помощью непрямого ELISA (S2 фиг.).Эти данные предполагают, что MCg1 может вызывать защитный иммунный ответ, который может частично объяснять ослабление MCg1. Необходимы дальнейшие исследования механизма ослабления MCg1.

У мышей, инфицированных MCg2, только у двух животных временно появлялась легкая неряшливая шерсть в течение 3 дней (рис. 2В), а у одной из мышей было небольшое очаговое воспаление в печени (таблица 3). У других инфицированных MCg2 и MCg3 животных клинических симптомов не наблюдалось. Кроме того, вирусы MCg2 и MCg3 не были обнаружены у инфицированных животных как при 17 dpi, так и при 42 dpi (рис. 3B).Гуморальный иммунитет играет ключевую роль в защите от аренавирусной инфекции Нового Света. Например, обработка иммунной плазмой с высокими уровнями нейтрализующих антител эффективно снижает уровень смертности от AHF и BHF у людей и нечеловеческих приматов (NHP), соответственно [23,24]. Хотя вирусы MCg2 и MCg3 авирулентны в мышиной модели, данные PRNT 50 показали, что оба вируса вырабатывают очень низкий уровень нейтрализующих антител против rMACV (таблица 2). Следовательно, в отличие от rMACV / Cd # 1-GPC [16], MCg2 и MCg3 могут не эффективно защищать хост от запроса MACV.Однако может потребоваться дополнительное тестирование на полностью иммунокомпетентных хозяевах, например, на морских свинках-аулеях, чтобы лучше понять их способность вызывать защиту.

Наши результаты показали важность всех доменов GPC в распространении вируса. Кинетика роста MCg1, который имеет SSP, TMD и CT домены MACV, была сопоставима с таковой для rMACV как в клетках Vero, так и в клетках A549 (рис. 1B и 1C). Титры MCg2 и MCg3, которые имеют мутацию F427I при TMD, были ниже, чем у MACV в клетках Vero при 24-48 hpi и, в частности, в клетках A549 при 24-96 hpi, что указывает на то, что мутация F427I при TMD незначительно влияла на вирус роста in vitro .Наши данные согласуются с другими результатами, показывающими роль GPC TMD в инфицировании аренавирусом in vitro . Предыдущий отчет продемонстрировал, что мутация F427I приводит к снижению инфекционности Cd # 1 в системе мини-генома, и предположил, что замена вызывает структурный дефект, который дестабилизирует метастабильную конформацию при нейтральном pH и снижает инфекционность вируса [25]. Другое исследование показало, что взаимодействие между SSP и TMD JUNV GPC может быть важным в слиянии вируса с мембраной хозяина [26].Помимо TMD, домены SSP и CT также могут вносить вклад в относительно более низкую репликацию MCg2 и MCg3 в культивируемых клетках. Исследование химерного Cd # 1 JUNV, экспрессирующего LASV GPC, продемонстрировало, что, хотя эктодомены Cd # 1 и LASV GPC могут обмениваться, вирус с гетерологичными SSP, TMD и CT не может быть спасен, что указывает на то, что гомологичные SSP, TMD и CT являются необходим для продукции инфекционного химерного вируса JUNV / LASV [27]. Соответственно, возможно, что менее эффективное размножение MCg2 и MCg3 может быть также связано с несовместимостью гетерологичных доменов SSP, TMD и CT. Гомологичные SSP, TMD и CT MACV в MCg1 и rMACV могут способствовать оптимальному размножению вирусов, в то время как гетерологичные SSP (MACV), CT (MACV) и TMD (Cd # 1) в MCg2 и MCg3 могут влиять на размножение вирусов в культивируемых клетки. Хотя влияние доменов SSP, TMD и CT на приспособленность вируса in vivo напрямую не исследуется, возможно, что мутации TMD или несовместимость гетерологичных доменов могут более серьезно повлиять на вирусную инфекцию in vivo и увеличить ослабление вируса. MCg2 и MCg3 в нашей модели мыши.Это может помочь объяснить наши данные о том, что ни вирус, ни нейтрализующие антитела к rMACV не могут быть обнаружены у животных, инфицированных MCg2 и MCg3, в отличие от группы MCg1. Более того, другие исследования предполагают, что SSP взаимодействует с эктодоменом GP2 [26]. Поэтому также возможно, что несовпадение MACV SSP с Cd # 1 GP2 в MCg1, MCg2 и MCg3 может способствовать ослаблению. Другой возможностью для более низких титров MCg2 и MCg3 является потенциально менее эффективное почкование и образование вирионов или более высокое отношение эквивалентов вирусного генома к БОЕ.

В совокупности мы продемонстрировали в нашем исследовании, что эктодомен Cd # 1 GPC вносит вклад в ослабление в rMACV / Cd # 1-GPC, хотя одного эктодомена недостаточно для полного ослабления. Наши новые результаты могут пролить свет на разработку вакцин-кандидатов не только против MACV, но и для других аренавирусов Нового Света.

Дополнительная информация

S1 Рис. Выравнивание аминокислотных последовательностей MACV, штамма JUNV Romero и Cd # 1 GPC.

Каждая область домена показана поверх последовательности.Аминокислотные последовательности MACV, штамма JUNV Romero и Cd # 1 GPC (регистрационный номер DDBJ / EMBL / GenBank: AIG51558.1, AAT40447.1 и AAU34180.1, соответственно) выравнивали с помощью Genetyx-Mac Ver.13 (Genetyx Corporation, Токио, Япония). Единственная аминокислота на TMD, вызывающая патогенность, показана стрелкой вверх (aa 438 для MACV и aa 427 для JUNV).

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004969.s001

(TIF)

S2 Рис.

Индукция rMACV-специфического IgG после инфицирования.

Измерение IgG с помощью ELISA выполняли для выявления иммунного ответа у мышей после заражения. Значение OD, полученное для лизатов неинфицированных клеток, использовали в качестве отрицательного контроля для лизатов клеток и вычитали из значения OD лизатов инфицированных клеток. Все протестированные образцы, за исключением двух образцов, собранных с разрешением 17 dpi (из группы, инфицированной MCg3, и группы, инфицированной rCd # 1), были положительными. Планки ошибок указывают на SEM (N = 3 для 17 точек на дюйм и N = 5 для 33/42 точек на дюйм или 42 точек на дюйм).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pntd.0004969.s002

(TIF)

S3 Рис. Патогистологические изменения мозга, селезенки и печени инфицированных мышей при 17 dpi.

Не наблюдалось значительных гистологических изменений у инфицированных MCg2 и MCg3 животных при 17 dpi и у животных, инфицированных rCd # 1 при 17 dpi и 42 dpi. Увеличение x4 (селезенка), x10 (мозговые оболочки и печень) и x20 (сосуд мозга).

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004969.s003

(TIF)

S1 Файл.Данные вирусного секвенирования в формате FASTA для сегмента S MCg1, MCg2 и MCg3.

Данные вирусного секвенирования для S-сегмента MCg1, MCg2 и MCg3 были депонированы в DDBJ / EMBL / GenBank (номер доступа: LC123592, LC123593 и LC123594, соответственно).

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004969.s004

(PDF)

Вклад авторов

  1. Концептуализация: TK CH SP.
  2. Обработка данных: TK AGW JNF.
  3. Формальный анализ: ТЗ.
  4. Получение финансирования: ТК СП.
  5. Расследование: ТК JFA MM JNS.
  6. Методология: ТК МП.
  7. Администрация проекта: ТЗ.
  8. Ресурсы: TK JNS.
  9. Программное обеспечение: ТЗ.
  10. Надзор: СП.
  11. Проверка: TK.
  12. Визуализация: ТЗ.
  13. Написание — черновик: ТЗ.
  14. Написание — просмотр и редактирование: ТК Ч СП.

Ссылки

  1. 1. Buchmeier MJ, de la Torre JC, Peters CJ (2007) Arenaviridae: вирусы и их репликация. В: Книпе Д.М., ПМ Х, редакторы. Области вирусологии. 5-е изд. Филадельфия, Пенсильвания, США: Уолтер Клувер Липпинкотт Уильямс и Уилкинс. С. 1791–1827.
  2. 2. Peters CJ (2002) Инфекция человека аренавирусами в Америке.Curr Top Microbiol Immunol 262: 65–74. pmid: 11987808
  3. 3. Кома Т., Хуанг С., Колокольцова О.А., Бразье А.Р., Паесслер С. (2013) Врожденный иммунный ответ на аренавирусную инфекцию: в центре внимания высокопатогенные геморрагические аренавирусы Нового Света. J Mol Biol 425: 4893–4903. pmid: 24075870
  4. 4. Дельгадо С., Эриксон Б.Р., Агудо Р., Блэр П. Дж., Валледжо Э. и др. (2008) Вирус Чапаре, недавно открытый аренавирус, выделенный в результате смертельного случая геморрагической лихорадки в Боливии.PLoS Pathog 4: e1000047. pmid: 18421377
  5. 5. Charrel RN, de Lamballerie X (2003) Аренавирусы, отличные от вируса Ласса. Antiviral Res 57: 89–100. pmid: 12615305
  6. 6. Паттерсон М., Грант А., Песслер С. (2014) Эпидемиология и патогенез боливийской геморрагической лихорадки. Curr Opin Virol 5: 82–90. pmid: 24636947
  7. 7. Амбросио А., Сааведра М., Мариани М., Гамбоа Г., Майза А. (2011) Вакцины от аргентинской геморрагической лихорадки. Hum Vaccin 7: 694–700.pmid: 21451263
  8. 8. McKee KT Jr., Oro JG, Kuehne AI, Spisso JA, Mahlandt BG (1992) Кандидатская вакцина № 1 от аргентинской геморрагической лихорадки защищает от смертельного заражения вирусом Хунин у макак-резусов. Интервирология 34: 154–163. pmid: 1338783
  9. 9. Lenz O, ter Meulen J, Klenk HD, Seidah NG, Garten W (2001) Гликопротеин-предшественник вируса Ласса GP-C протеолитически процессируется субтилазой SKI-1 / S1P. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 12701–12705. pmid: 11606739
  10. 10.Нунберг Дж. Х., Йорк Дж. (2012) Любопытный случай проникновения аренавируса и его ингибирования. Вирусы 4: 83–101. pmid: 22355453
  11. 11. Фланаган М.Л., Ольденбург Дж., Рейнье Т., Холт Н., Гамильтон Г.А. и др. (2008) Аренавирусы клады B нового мира могут использовать зависимые и независимые от трансферрина рецептора 1 (TfR1) пути входа, а гликопротеины из патогенных штаммов человека связаны с использованием TfR1. J Virol 82: 938–948. pmid: 18003730
  12. 12. Радошицкий С.Р., Абрахам Дж., Спиропулу С.Ф., Кун Дж. Х., Нгуен Д. и др.(2007) Рецептор трансферрина 1 является клеточным рецептором аренавирусов геморрагической лихорадки Нового Света. Природа 446: 92–96. pmid: 17287727
  13. 13. Цао В., Генри, доктор медицины, Борау П., Ямада Х., старейшина Дж. Х. и др. (1998) Идентификация альфа-дистрогликана как рецептора вируса лимфоцитарного хориоменингита и вируса лихорадки Ласса. Science 282: 2079–2081. pmid: 9851928
  14. 14. Spiropoulou CF, Kunz S, Rollin PE, Campbell KP, Oldstone MB (2002) Аренавирус Нового Света клада C, но не вирусы клады A и B, используют альфа-дистрогликан в качестве своего основного рецептора.J Virol 76: 5140–5146. pmid: 11967329
  15. 15. Серегин А.В., Юн Н.Е., Миллер М., Аронсон Дж., Смит Дж. К. и др. (2015) Ген-предшественник гликопротеина вируса юнина определяет вирулентность штамма romero и ослабление штамма Candida # 1 в репрезентативной модели аргентинской геморрагической лихорадки на животных. J Virol 89: 5949–5956. pmid: 25810546
  16. 16. Кома Т., Паттерсон М., Хуанг С., Серегин А.В., Махарадж П.Д. и др. (2015) Вирус Мачупо, экспрессирующий GPC из вакцинного штамма кандидата № 1 вируса Хунина, является сильно ослабленным и иммуногенным.J Virol 90: 1290–1297. pmid: 26581982
  17. 17. Альбарино К.Г., Берд Б.Х., Чакрабарти А.К., Додд К.А., Флинт М. и др. (2011) Главный детерминант ослабления вакцины Candid1 от аргентинской геморрагической лихорадки у мышей находится в трансмембранном домене гликопротеина G2. J Virol 85: 10404–10408. pmid: 21795336
  18. 18. Паттерсон М., Кома Т., Серегин А., Хуанг С., Миллер М. и др. (2014) Замена в трансмембранной области гликопротеина приводит к нестабильному ослаблению вируса Мачупо.J Virol 88: 10995–10999. pmid: 25031335
  19. 19. Паттерсон М., Серегин А., Хуанг С., Колокольцова О., Смит Дж. И др. (2014) Спасение рекомбинантного вируса Мачупо из клонированных кДНК и характеризация in vivo у мышей с двойным нокаутом по рецептору интерферона (алфавита / гамма). J Virol 88: 1914–1923. pmid: 24284323
  20. 20. Эмонет С.Ф., Серегин А.В., Юн Н.Е., Пуссар А.Л., Уокер А.Г. и др. (2011) Спасение от клонированных кДНК и характеристика in vivo рекомбинантных патогенных штаммов Romero и живых аттенуированных штаммов Candid # 1 вируса Junin, возбудителя аргентинской геморрагической лихорадки.J Virol 85: 1473–1483. pmid: 21123388
  21. 21. Юн Н.Е., Линде Н.С., Дзюба Н., Закс М.А., Смит Дж. Н. и др. (2008) Патогенез штаммов XJ и Romero вируса Хунин у двух штаммов морских свинок. Am J Trop Med Hyg 79: 275–282. pmid: 18689636
  22. 22. Колокольцова О.А., Грант А.М., Хуанг С., Смит Дж. К., Пуссар А.Л. и др. (2014) RIG-I усиливал интерферон-независимый апоптоз при инфицировании вирусом Хунин. PLoS One 9: e99610. pmid: 24918927
  23. 23. Maiztegui JI, Fernandez NJ, de Damilano AJ (1979) Эффективность иммунной плазмы при лечении аргентинской геморрагической лихорадки и связь между лечением и поздним неврологическим синдромом.Ланцет 2: 1216–1217. pmid: 92624
  24. 24. Эдди Г.А., Вагнер Ф.С., Скотт С.К., Маландт Б.Дж. (1975) Защита обезьян от вируса Мачупо путем пассивного введения иммуноглобулина боливийской геморрагической лихорадки (человеческого происхождения). Bull World Health Organ 52: 723–727. pmid: 182406
  25. 25. Droniou-Bonzom ME, Reignier T., Oldenburg JE, Cox AU, Exline CM, et al. (2011) Замены в гликопротеине (GP) вакцинного штамма Candid # 1 вируса Хунин увеличивают зависимость от человеческого рецептора 1 трансферрина для входа и дестабилизируют метастабильную конформацию GP. J Virol 85: 13457–13462. pmid: 21976641
  26. 26. York J, Nunberg JH (2009) Межсубъединичные взаимодействия модулируют pH-индуцированную активацию слияния мембран с помощью гликопротеина оболочки вируса Хунина GPC. J Virol 83: 4121–4126. pmid: 19224989
  27. 27. Альбарино К.Г., Берд Б.Х., Чакрабарти А.К., Додд К.А., Уайт Д.М. и др. (2011) Обратная генетическая генерация химерного инфекционного вируса Хунин / Ласса зависит от взаимодействия гомологичного стабильного сигнального пептида гликопротеина и цитоплазматических доменов G2.J Virol 85: 112–122. pmid: 20980515

границ | Отсутствие мотива N-связанного гликозилирования в гликопротеине живой аттенуированной вакцины против аргентинской геморрагической лихорадки Candid # 1 приводит к ее неправильной обработке и снижению поверхностной экспрессии

Введение

Аренавирус Хунин Нового Света (JUNV) вызывает у людей аргентинскую геморрагическую лихорадку (AHF) — тяжелое потенциально смертельное заболевание, эндемичное для центральных регионов Аргентины. Геном вируса состоит из двух одноцепочечных сегментов отрицательной смысловой РНК, малого (S) и большого (L). Оба сегмента генома используют стратегию кодирования амбисенса для кодирования двух вирусных белков, которые экспрессируются в противоположной ориентации (рис. 1). Сегмент L-РНК (~ 7 т.п.н.) кодирует вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу (LP), которая реплицирует и транскрибирует геном вирусной РНК, и небольшой цинк-связывающий белок пальца RING (Z), который является аренавирусным аналогом матриксного белка, обнаруженного в многие вирусы с отрицательной цепью РНК.Z выполняет множество функций в цикле репликации вируса, включая образование и отпочкование вирионов из плазматической мембраны, негативную регуляцию активности комплекса репликации вируса и модуляцию ответа клетки-хозяина на инфекцию (Fehling et al., 2012). Сегмент S-РНК (~ 3,4 т.п.н.) кодирует предшественник гликопротеина (GPC) и нуклеопротеин (NP). GPC ко- и посттрансляционно процессируется клеточными протеазами с образованием гликопротеинов G1 и G2 и стабильного сигнального пептида (SSP), который формирует гликопротеиновые комплексы G1 / G2 / SSP, присутствующие на поверхности зрелых вирионов и ответственные за распознавание вирусных рецепторов и проникновение в клетки через рецептор-опосредованный эндоцитоз (Burri et al. , 2012). NP является наиболее распространенным вирусным белком как в инфицированных клетках, так и в вирионах. NP служит важным кофактором для транскрипции РНК LP, а также блокирует обнаружение вирусной РНК с помощью клеточных механизмов противовирусной защиты (Buchmeier et al., 2013).

Рисунок 1. Сравнение транскрипционной активности между полимеразными комплексами химерных вариантов JUNV . (A) Схематическое изображение геномов rJUNV. Черный и серый цвета указывают на генетический материал штаммов Rom и Can JUNV соответственно. (B) Уровни антигеномной (агРНК) РНК сегмента S и мРНК гена NP в клетках Vero, инфицированных rJUNV. Клетки инфицировали при MOI 5 и собирали через 24 ч p.i. Тотальную РНК выделяли и анализировали с помощью Нозерн-блоттинга на наличие видов вирусной РНК. Равную загрузку образца и целостность РНК контролировали окрашиванием EtBr 18S рРНК. Денситометрию рассчитывали с использованием AlphaEase TM , чтобы определить насыщенность каждой полосы. Насыщенность полосы выделенной области отображается по шкале от 0 до 255. (C) Сравнение активности Rom и Can LP в анализах минигенома (MG). Клетки BHK-21S трансфицировали управляемыми промотором pol-I мышиными конструкциями минигенома (MG) на основе S-сегмента, экспрессирующими люциферазу светлячка вместо гена GPC (ΔGPC / Luc) или NP (ΔNP / Luc) вместе с экспрессией pol-II. конструкции для ЛП и НП. Уровни экспрессии люциферазы определяли через 48 ч после трансфекции конструкциями Rom (Rom MG / LP + NP) или Can (Can MG / LP + NP). RLU, относительные световые единицы. (D) Относительное накопление вирусной РНК, транскрибированной с локуса гена NP (Di) или Z (Dii) . Клетки Vero инфицировали в тех же условиях, что и в случае (B) (MOI 5), и собирали через 24 часа через день. Количественную ОТ-ПЦР с использованием красителя SYBR Green проводили в трех повторностях. Уровни вирусной РНК, нормализованные к мРНК GAPDH, выражаются как отношение к уровню вирусной РНК в клетках, инфицированных rRom. Показаны средние значения и стандартные отклонения. Ромеро, Ромеро.Откровенный, кандидат №1. RoL / CaS, rRomL / CanS. CaL / RoS, rCanL / RomS. Ro / CaNP, rRom / CanNP. Ro / CaGPC, rRom / CanGPC. Ro / CaLP, rRom / CanLP. Ro / CaZ, rRom / CanZ.

G2-опосредованное слияние вирусной и клеточной мембран в кислой среде эндосомы высвобождает вирусный рибонуклеопротеин (вРНП) в цитоплазму клетки, что сопровождается началом синтеза вирусной РНК. Репликация и экспрессия генома аренавируса строго регулируются во время заражения. После доставки генетического материала в цитоплазму вирусная полимераза инициирует синтез геномных и антигеномных сегментов РНК, а также мРНК вирусных генов.Исследования прототипных клеток, инфицированных аренавирусом LCMV, показали, что максимальный уровень синтеза вирусной РНК, предшествующий пиковым вирусным титрам, сопровождался заметным снижением скорости продукции РНК (Cornu and de la Torre, 2001). Таким образом, были предложены две фазы цикла репликации аренавируса: фаза репликации и экспрессии активного генома и фаза сборки и почкования вириона. Z не требуется для синтеза РНК, опосредованного vRNP, но было показано, что Z проявляет дозозависимый ингибирующий эффект на активность vRNP (Cornu and de la Torre, 2001).Впоследствии исследования аренавируса Мачупо Нового Света (MACV) демонстрируют, что Z образует прямой гетеродимерный комплекс с гомологичным LP и блокирует LP в связанной с промотором форме, тем самым предотвращая копирование LP матричной РНК генома. Интересно, что способность Z ингибировать активность LP из гетерологичных аренавирусов коррелирует со степенью генетической дистанции между вирусами. Таким образом, Z отдаленно родственного аренавируса Старого Света LCMV не взаимодействует и не ингибирует функциональную активность MACV LP (Kranzusch and Whelan, 2011).Предполагается, что это Z-опосредованное ингибирование vRNP-направленного синтеза вирусной РНК играет важную роль в регуляции жизненного цикла аренавируса. Таким образом, на ранней стадии инфекции низкая концентрация Z делает возможным активный синтез вирусной РНК; однако накопление с течением времени высоких уровней Z в инфицированных клетках приводит к блокировке комплекса Z-LP, связанного с вирусным промотором, что может способствовать включению вирусной полимеразы в вирионы аренавируса (Kranzusch et al. , 2010; Kranzusch and Whelan , 2011).

Было продемонстрировано, что изменение одной аминокислоты в трансмембранной области Candid # 1 (Can) G2 значительно ослабляет нейровирулентность JUNV у мышей (Albariño et al., 2011), и на модели морской свинки, которая близко воспроизводит ключевые особенности ОСН человека. (Emonet et al., 2011). Эта мутация, F427I, как было показано, дестабилизирует метастабильную конформацию гликопротеинового комплекса, запуская переход к фузогенной конформации при нейтральном pH. Это могло бы ограничить распространение Can в тканях (Droniou-Bonzom et al., 2011). Однако мутация F427I произошла во время пассажей в клетках FRhL-2 легких плодов макаки-резуса (Ambrosio et al., 2011) и не может объяснить ослабленный фенотип, связанный со штаммами JUNV, предшественниками Can, XJ37 и XJ44 (Yun et al., 2008 ).

Ранее было продемонстрировано, что GPC LCMV индуцирует стресс эндоплазматического ретикулума (ER) и запускает ответ развернутого белка (UPR) (Pasqual et al. , 2011). Таким образом, острая инфекция, вызванная LCMV, индуцировала выработку белка, связывающего тяжелую цепь иммуноглобулина (BiP), резидентного белка ER, который обеспечивает начальную помощь в складывании полностью развернутых или неструктурированных растущих полипептидных цепей (Schroder, 2008) и выборочно активирует активирующие Ответвление UPR, контролируемое фактором транскрипции 6 (ATF6), в то время как пути, регулируемые протеинкиназной РНК-подобной ER-киназой (PERK) и киназой / эндонуклеазой инозитол-требующим протеина 1 (IRE1), не были ни активированы, ни блокированы.Экспрессия отдельных белков LCMV продемонстрировала, что только продукция GPC запускала опосредованный ATF6 UPR, наблюдаемый во время заражения LCMV. Важно, что быстрое подавление экспрессии GPC во время перехода от острой инфекции LCMV к стойкой разрешает стрессовые состояния ER и возвращает передачу сигналов UPR на базальные уровни (Pasqual et al., 2011).

Здесь мы представляем доказательства того, что клетки, инфицированные rJUNV, экспрессирующие GPC Can, демонстрируют более высокие уровни синтеза РНК и продукции белка, чем клетки, инфицированные rJUNV, экспрессирующие GPC патогенного штамма Rom JUNV. Мы также показываем, что Can GPC демонстрирует нарушенный процессинг и измененный трафик, что способствует индукции стрессового ответа ER и способности GPC взаимодействовать с Z. Измененное взаимодействие GPC-Z может влиять на регуляцию репликации и экспрессии вирусного генома, что может способствовать усилению иммуногенность Can.

Материалы и методы

Клетки и вирусы

клеток Vero почечного эпителия африканской зеленой мартышки, клеток эмбриональной почки человека (HEK) 293 и почки детеныша хомячка (BHK-21) (Американская коллекция культур тканей) поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко с добавлением 10% (Vero и HEK 293) и 5% (BHK-21) фетальная телячья сыворотка (HyClone) и раствор антибиотика-антимикотика (Gibco).Генерация и in vitro, и in vivo. Характеристика химерного rJUNV, используемого в текущем исследовании, была описана ранее (Emonet et al., 2011; Seregin et al., 2015). Вкратце, кДНК обоих геномных сегментов Rom (номера доступа GenBank AY619640 и AY619641) и Can (номера доступа GenBank AY746353 и AY746354) клонировали в антигеномной ориентации в плазмидный вектор, содержащий промотор мышиной РНК-полимеразы I (mPol-I), для получения Плазмиды mPol-I-Sag и mPol-I-Lag. Открытые рамки считывания (ORF) минимальных вирусных транс-действующих факторов, NP и LP, необходимых для репликации и транскрипции РНК полимеразным комплексом JUNV, были клонированы в плазмидный вектор экспрессии РНК-полимеразы II (pol-II) для генерации pC -NP и pC-LP плазмиды. Химерные rJUNV были созданы путем генной инженерии ORF генов Can в геном Rom. rJUNV были спасены в клетках BHK21 путем трансфекции соответствующими плазмидами mPol-I-Sag и mPol-I-Lag вместе с плазмидами pol-II pC-NP и pC-LP, экспрессирующими NP LP Rom.Штаммы вирусов получали путем инфицирования клеток Vero [множественность инфекции (MOI) = 0,01] и сбора вирусосодержащих супернатантов тканевых культур (TCS) через 4 дня после инфицирования (пи) с последующим удалением клеточного дебриса центрифугированием (10000 g в течение 10 мин при 4 ° C). Работа с вирулентными штаммами JUNV проводилась в учреждениях UTMB с уровнем биобезопасности 4 (BSL-4) в соответствии с установленными правилами охраны здоровья и безопасности.

Нозерн-блоттинг

Суммарную РНК

из инфицированных клеток, лизированных в TRIzol Reagent (Invitrogen), выделяли с использованием набора Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research), следуя протоколу производителя в трех повторностях.Нозерн-блоттинг выполняли с использованием набора NorthernMax-Gly (Ambion). Вкратце, 1 мкг общей РНК денатурировали в загрузочном буфере глиоксаля, содержащем EtBr, при 50 ° C в течение 30 мин. РНК разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле с низким электроэндосмосом (LE) и переносили на положительно заряженную нейлоновую мембрану BrightStar-Plus (Ambion) путем пассивного переноса вниз в течение 2 часов. Перед гибридизацией с РНК-зондами окрашенная EtBr 18S рРНК была визуализирована в длинноволновом УФ-свете и сфотографирована для оценки качества РНК и обеспечения равной загрузки образцов.Чтобы подготовить РНК-зонд для обнаружения видов S-gRNA и GPC mRNA, ПЦР-фрагмент 590 нуклеотидов амплифицировали из Romero mPol-I-Sag, охватывающего позиции 743–1333 S-сегмента. Зонд in vitro был транскрибирован с использованием набора MAXIscript T7 (Ambion) из промотора T7, включенного в отжиг праймера в положении 743, и биотинилирован с использованием набора BrightStar Psoralen-Biotin (Ambion) в соответствии с протоколами, предоставленными производителем. РНК-зонд, нацеленный на виды S agRNA и NP мРНК, был синтезирован из 544-нуклеотидного ПЦР-фрагмента, охватывающего положения 1870–2414 S-сегмента генома Romero (промотор T7 был включен в отжиг праймера в положении 2414).Блоты гибридизовали с биотинилированными РНК-зондами при 0,1 нМ в течение ночи при 68 ° C с последующей одной промывкой низкой строгости в течение 10 минут при комнатной температуре и двумя промывками высокой строгости в течение 15 минут при 68 ° C. Сигналы гибридизации детектировали с помощью набора для неизотопного обнаружения BrightStar BioDetect (Ambion). Плотность полос нозерн-блоттинга определяли количественно с использованием программного обеспечения AlphaEaseFC TM .

Количественная ПЦР в реальном времени

Суммарную РНК

из JUNV-инфицированных клеток выделяли в трех повторностях, как описано для экспериментов Нозерн-блоттинг.Количественное определение вирусной РНК проводили в трех экземплярах с использованием набора iScript One-Step RT-PCR Kit с SYBR Green (Bio-Rad) с 100 нг общей РНК. Для детекции использовали следующие праймеры: NP direct, GGTCCTTCAATGTCGAGCCA; NP обратный, AATCACAGGCAGGTCATGGG; Z прямой, AAGTGCTGCTGGTTTGC TGA; Z обратный, TCCACCGGTACTGTGATTGTG, GAPDH-Vero прямой, AGTCAACGGATTTGTCGTA; GAPDH-Vero обратный, GGGTGGAATCATACTGGAAC; GAPDH-морская свинка прямой, TACGACAAGTCCCTCAAGATTG; GAPDH-обратная морская свинка, TCTGGGTGGCAGTGATGG.Анализ кривой плавления выполняли для подтверждения специфичности ПЦР-фрагмента. Пороги цикла выборки (Ct) были нормализованы к значениям Ct GAPDH. Относительные количества вирусной РНК в инфицированных клетках и тканях рассчитывали относительно РНК rRomero с использованием уравнения 2 — ΔCt , где ΔCt , образец = (Ct , образец — Ct GAPDH / образец ) — (Ct rRomero — Ct GAPDH / rRomero ) (Pfaffl, 2001).

Анализ минигеномной люциферазы

Минигеномные (MG) репортерные конструкции люциферазы были созданы путем замены обоих вирусных генов, кодируемых сегментом S в Rom и Can mPol-I-Sag, генами люциферазы светлячка (Fluc) и зеленого флуоресцентного белка (GFP).Следовательно, для каждого штамма JUNV были созданы две репортерные конструкции, кодирующие Fluc вместо GPC или NP. Для проведения анализа люциферазы MG клетки BHK-21 (засеянные при 1 × 10 5 / лунку в 12-луночном планшете) трансфицировали в трех повторностях эквимолярными количествами pC-NP, pC-L, и указанные конструкции MG составляли общую в 2 мкг плазмидной ДНК на лунку. Клетки в каждой лунке также котрансфицировали экспрессионной плазмидой для люциферазы Renilla (100 нг / лунку), чтобы нормализовать люминесценцию Fluc между образцами.Спустя 48 часов экспрессию репортерного гена Fluc анализировали с использованием системы анализа люциферазы Dual-Glo (Promega) в соответствии с протоколом производителя.

Вестерн-блоттинг

Инфицированные или трансфицированные клетки собирали в загрузочном буфере Laemmli SDS (65,8 мМ трис-HCl, pH 6,8, 2,1% SDS, 26,3% (мас. / Об.) Глицерина, 0,01% бромфенолового синего, 10% β-меркаптоэтанола) (Bio- Рад). Образцы кипятили при 95 ° C в течение 5 минут перед фракционированием с помощью SDS-PAGE в 4–15% гелях Mini-Protean TGX (Bio-Rad).Белки переносили на мембраны из поливинилдифторида (PVDF) с использованием системы электропереноса Trans-Blot Turbo (Bio-Rad) в соответствии с протоколом производителя. После переноса мембраны промывали дистиллированной водой и блокировали PBS-T (10 мМ фосфат натрия, 0,15 M NaCl, 0,1% Tween-20, pH 7,5), содержащим 5% обезжиренного сухого молока, в течение 1 ч при комнатной температуре. . Затем мембраны зондировали первичными антителами, разведенными в блокирующем буфере (1: 1000) при 4 ° C в течение ночи, трижды промывали в течение 15 минут PBS-T и инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP). (Cell Signaling) в PBS-T (1: 1000) в течение 1 ч при комнатной температуре.После еще одной промывки в PBS-T сигнал HRP визуализировали по усиленной хемолюминесценции (ECL) (ECL Western Blotting System, Amersham). Каждый вестерн-блот проводился в трех экземплярах, и был представлен репрезентативный блот. Первичные поликлональные антитела, нацеленные на JUNV G2 и Z, были индуцированы у кроликов против синтетических пептидов, соответствующих аминокислотным последовательностям GKYPNLKKPTVWRR и GASKSNQPDSSRAT (ProSci), соответственно, которые полностью консервативны между Romero и Candid # 1. Моноклональное антитело против NP NA05-AG12 было получено из репозитория ресурсов исследования биозащиты и возникающих инфекций (BEI Resources).Антитела против BiP и β-актина были приобретены у Cell Signaling Technology, Inc.

.

Конфокальная микроскопия

клеток BHK-21S высевали на покровные стекла NeuVitro (12 мм, толщина 1,5, покрытые PDL) с использованием DMEM, содержащей 5% FBS. Через 24 часа клетки трансфицировали плазмидами, управляемыми CMV, экспрессирующими Romero, XJ13, XJ44, Candid, RomT168A или CanA168T GPC. Все трансфекции выполняли с использованием реагента для трансфекции XtremeGENE-9 (Roche) в соответствии с протоколом производителя.Трансфицированные клетки инкубировали в течение 36 часов и фиксировали 4% параформальдегидом в течение 10 минут, затем повышали проницаемость в течение 2 минут, используя 0,1% Triton-X100 в PBS. Клетки окрашивали красителем CytoPainter Red ER (Abcam) и окрашиванием ядра Hoechst 33342 в соответствии с протоколом производителя, затем окрашивали моноклональным мышиным антителом против JUNV GPC (BE08, BEI Resources) в течение 1 ч при комнатной температуре с последующим повторным окрашиванием AlexaFluor 488. козьи антимышиные антитела (Life Technologies) в течение 1 ч при комнатной температуре, каждое в разведении 1: 500.Покровные стекла помещали на предметные стекла с помощью монтажного раствора MOWIOL и давали высохнуть в течение 24 часов. Все изображения были получены с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM 510. Представленные изображения были репрезентативными для нескольких кадров обзора для каждого образца.

Проточная цитометрия

клеток HEK293 высевали в 12-луночные планшеты в среде DMEM, содержащей 5% FBS. Через 24 часа клетки трансфицировали в трех повторностях, используя те же условия, что описаны для конфокальной микроскопии. Клетки инкубировали в течение 36 ч, затем помещали в одноклеточную суспензию с последующей фиксацией в 4% параформальдегиде в течение 10 мин при комнатной температуре.Окрашивание выполняли с использованием моноклональных мышиных антител против JUNV GPC (BE08, BEI, Resources) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем вторичных антител козы против мышиных антител, конъюгированных с APC (Life Technologies), в течение 1 ч при комнатной температуре с использованием Разведение 1: 500 для каждого.

Результаты

Ослабленные варианты JUNV демонстрируют более высокий уровень синтеза РНК в инфицированных клетках, чем вирулентные варианты

Мы ранее описали генерацию рекомбинантного JUNV (rJUNV), кодирующего различные комбинации генов патогенного Rom и аттенуированного штамма Can вируса (Seregin et al. , 2015) и идентифицировали GPC как главную вирусную детерминанту вирулентности и аттенуации JUNV в модели AHF у морских свинок (Seregin et al., 2015). Чтобы получить дальнейшее представление о молекулярной основе, с помощью которой GPC определяет вирулентность по сравнению с ослаблением вирулентности JUNV in vivo , мы исследовали дифференциальные паттерны синтеза вирусной РНК и экспрессии генов в клетках, инфицированных различными меж- и внутрисегментными химерными rJUNV (рис. 1A). ). С этой целью клетки Vero инфицировали (MOI = 5) меж- и внутрисегментными химерными JUNV и определяли внутриклеточные уровни вирусной РНК с помощью Нозерн-блоттинга.Чтобы количественно оценить каждую из полос в Нозерн-блоте, использовали программное обеспечение AlphaEase TM для сравнения интенсивности полос. Значения, перечисленные под каждой полосой (рис. 1В), представляют собой насыщенность полосы по шкале от 0 до 255. Интересно то, что мы определили, что клетки, инфицированные rJUNV, которые проявляли вирулентный фенотип у морских свинок и экспрессировали Rom GPC (rRom, rCanL / RomS и rRom / CanNP), накапливали меньшее количество антигеномной РНК S-сегмента и мРНК NP, чем клетки, инфицированные вирусами. которые были аттенуированы у морских свинок и экспрессировали GPC Can (rCan, rRomL / CanS и rRom / CanGPC) (Фигуры 1B, Di).Хотя экспрессия агРНК вируса rCanL / RomS была статистически ниже ( p <0,05), чем экспрессия агРНК в аттенуированных вирусах, разница не была столь выражена, как разница между аттенуированными вирусами и либо rRom, либо rRom / CanNP ( p <0,05). И rRom, и rRom CanNP экспрессировали в три раза меньше агРНК, чем аттенуированные вирусы. Мы получили аналогичные результаты для уровней геномной S-РНК и мРНК GPC (данные не показаны). Затем уровни синтеза РНК L- и S-сегментов оценивали с помощью количественной ПЦР с использованием локусов Z и NP соответственно (кПЦР).Данные, наблюдаемые при кПЦР, были аналогичны данным, полученным для агРНК в Нозерн-блотах, с точки зрения относительной экспрессии РНК. Общие уровни Z (L-сегмент) и NP (S-сегмент) РНК были выше в клетках Vero, инфицированных ослабленными вариантами rJUNV (Фигуры 1Di, Dii). Это указывает на то, что экспериментальные данные, полученные с помощью кПЦР, согласуются с данными, полученными в экспериментах с Нозерн-блоттингом. Небольшие различия в относительной экспрессии РНК, вероятно, могут быть связаны с тем фактом, что qPCR обнаруживает как геномную РНК, так и мРНК, тогда как данные Нозерн-блоттинга различают их.

Чтобы исследовать возможные причины наблюдаемых расхождений в уровнях синтеза вирусной РНК, мы исследовали уровни активности vRNP Rom и Can, используя установленные системы спасения минигенома (MG), основанные на S-сегментах Rom и Can (Lee et al., 2000). ), где репортерный маркер люциферазы светлячка заменял либо GPC, либо NP JUNV. Неожиданно мы наблюдали сходную экспрессию люциферазы светлячка с гомологичными комбинациями LP / NP Rom и Can (рис. 1C). В совокупности данные показывают, что в клетках, инфицированных различными rJUNV, уровни синтеза вирусной РНК не определялись активностью ядра vRNP.

Вирулентные и ослабленные варианты rJUNV демонстрируют различные паттерны и кинетику экспрессии белка в инфицированных клетках

Из-за различий в экспрессии РНК между rJUNV мы решили сравнить паттерны экспрессии и кинетику продукции вирусного белка между спасенными rJUNV (рис. 2А). Анализ экспрессии GP в инфицированных rJUNV клетках Vero выявил два различных паттерна экспрессии белка для rJUNV, которые проявляли вирулентный фенотип у морских свинок и экспрессировали Rom GPC и вирусы, которые были аттенуированы у морских свинок и экспрессировали Can GPC.Лизаты клеток, инфицированных аттенуированными вирусами (экспрессирующими Can GPC), демонстрировали различия в уровнях нерасщепленного G1G2, которые коррелировали с наличием промежуточных полос между G1G2 и G2 в Вестерн-блоттинге. Пропорция между количествами G2 и нерасщепленного G1G2 заметно различалась, как показывает количественная оценка денситометрии (AlphaEase TM ) полос G1G2 и G2 для каждого образца. Вирусы, экспрессирующие Can GPC, экспрессировали относительно равное количество нерасщепленного G1G2 и расщепленного G2, тогда как вирусы, экспрессирующие Rom GPC, экспрессировали трехкратное (CaL / RoS) или четырехкратное (Romero, Ro / CaNP) увеличение расщепленного G2 по сравнению с нерасщепленным G1G2. (Рисунок 2A).Кроме того, есть две промежуточные полосы между размерами G1G2 и G2 в клетках, инфицированных вирусами, экспрессирующими Can GPC. Хотя эти полосы не присутствуют в клетках, инфицированных вирусами, экспрессирующими Rom GPC, неясно, связано ли это с более низкой общей экспрессией белка в этих образцах или полосы указывают на проблему обработки с Can GPC (рис. 2A). Из-за дополнительного неспецифического связывания нашего антитела с белками A549 эти полосы трудно обнаружить в клетках A549.Относительные уровни G1G2 и G2 для каждого rJUNV аналогичны в A549-инфицированных клетках, что указывает на то, что отношения G1G2: G2, наблюдаемые в клетках Vero, не являются специфичными для конкретного типа клеток (рис. 2D).

Рисунок 2. Профили экспрессии белков и кинетика химерных вариантов JUNV. (A) Дифференциальная экспрессия белков клетками Vero, инфицированными при MOI, равном 5. Клетки лизировали в буфере для образцов Лэммли SDS при 48 ч p.i. Вирусные белки детектировали вестерн-блоттингом с использованием антител, индуцированных против консервативных областей G2, NP и Z между Rom и Can. Клеточные белки детектировали с помощью коммерчески доступных антител. Денситометрию рассчитывали с использованием AlphaEase TM , чтобы определить насыщенность каждой полосы. Насыщенность полосы выбранной области представлена ​​по шкале от 0 до 255. (B) Кинетика экспрессии NP. Клетки Vero, инфицированные при MOI 0,1, собирали в указанные моменты времени и определяли уровни экспрессии NP с помощью вестерн-блоттинга. Равную загрузку образцов контролировали по окрашиванию синим Комасси (не показано). (C) Профиль экспрессии GPC и кинетика экспрессии между rRom (Romero) и rCan (Candid). Клетки Vero инфицировали при MOI, равном 5, и клеточные лизаты собирали в указанные моменты времени. Вестерн-блот анализировали антителом против G2. (D) Дифференциальная экспрессия вирусного GPC и маркера UPR BiP в клетках A549, инфицированных химерным rJUNV. Клетки инфицировали при MOI, равном 5, и собирали при 48 часах в день. Уровни вирусных и клеточных белков определяли вестерн-блоттингом. Ромеро, Ромеро. Откровенный, кандидат №1. RoL / CaS, rRomL / CanS. CaL / RoS, rCanL / RomS. Ro / CaNP, rRom / CanNP. Ro / CaGPC, rRom / CanGPC. Ro / CaLP, Vero, лизат ложно инфицированных клеток Vero. A549, лизат ложно инфицированных клеток A549.

Интересно, что общее количество G2 и G1G2 и количество NP, накопленных в клетках через 48 часов после заражения, были выше для rJUNV, которые были аттенуированы у морских свинок, по сравнению с вирусами, которые были вирулентными для морских свинок (рис. 2A). . Различия в уровнях экспрессии NP проявлялись рано после заражения и сохранялись в течение 44 часов после заражения (рис. 2В).Точно так же различия в общих количествах GPC между вирулентным и аттенуированным rJUNV (рис. 2A) также наблюдались сначала на ранних этапах p.i. и сохранялись на протяжении всего периода инфицирования (рис. 2C). Интересно, что наличие дополнительных полос GPC и увеличение количества нерасщепленного G1G2 коррелировало с более низкими количествами Z (рис. 2А), несмотря на наблюдаемые более высокие уровни РНК в локусе гена Z (рис. 1Dii). Вместе эти результаты демонстрируют, что меж- и внутрисегментный rJUNV, экспрессирующий Can GPC, демонстрирует отчетливый профиль экспрессии вирусного белка в инфицированных клетках, который заметно отличается от профиля экспрессии rJUNV, экспрессирующего GPC вирулентного штамма Rom, и эти вирусы экспрессируют больше белка в целом с за исключением З.

Посттрансляционная обработка Can GPC и реакция на стресс ER в клетках, инфицированных и трансфицированных GPC

Межсегментные и внутрисегментные химерные JUNV, экспрессирующие GPC аттенуированного Can, проявляли отчетливый профиль экспрессии вирусного белка в инфицированных клетках, который заметно отличался от такового для вирусов, экспрессирующих GPC вирулентного Rom (фиг. 2A). Сравнение профилей экспрессии GPC в клетках Vero и A549 показало, что наличие дополнительных полос промежуточных размеров между G2 и G1G2 для rJUNV, экспрессирующего GPC Can. Присутствие этих промежуточных полос коррелирует с увеличением присутствия нерасщепленного G1G2 в клеточных лизатах, предполагая, что эти полосы могут быть связаны с проблемой ко- или посттрансляционной обработки. Это наблюдалось как в клетках приматов, так и в клетках человека, что позволяет предположить участие ко- или посттрансляционных механизмов процессинга, консервативных для обоих видов. Эти результаты позволили нам предположить, что возникающий GPC Can подвергается аномальной обработке, что приводит к снижению продукции полностью обработанного G2, накоплению ER аномально обработанных GPC в ER и индукции ER стресса.Чтобы проверить эту гипотезу, мы оценили уровни экспрессии BiP в клетках Vero и A549, инфицированных rJUNV, экспрессирующих GPC Can или Rom. BiP представляет собой белок-шаперон ER, который воспринимает развернутые белки (UP) в просвете ER и активирует клеточный UP-ответ (UPR) (Liu et al., 2003). Активация экспрессии BiP ранее использовалась для демонстрации индукции UPR в инфицированных LCMV клетках (Pasqual et al., 2011). Примечательно, что клетки Vero (фиг. 2A) и A549 (фиг. 2B) показали увеличение экспрессии BiP при инфицировании rJUNV, экспрессирующими Can GPC.Напротив, уровни экспрессии BiP были лишь незначительно повышены в клетках, инфицированных rJUNV, экспрессирующими Rom GPC. Продолжительный стресс неразрешенного ER может привести к индукции апоптоза, который может играть роль в ослабленном фенотипе и иммуногенности Can (Tabas and Ron, 2011). Поэтому мы исследовали клетки, инфицированные нашими химерными rJUNV, на наличие маркеров, связанных с передачей сигналов апоптоза, индуцированного стрессом ER. Клетки, инфицированные rJUNV, экспрессирующими Can GPC, показали более высокие уровни расщепленной каспазы 3 и небольшое увеличение как каспазы 7, так и поли (АДФ-рибоза) полимеразы (PARP) по сравнению с клетками, инфицированными rJUNV, экспрессирующими Rom GPC.Это указывает на то, что экспрессия Can GPC, но не Rom GPC, способствует проапоптотической передаче сигналов UPR в инфицированных клетках (фиг. 2A).

Для дальнейшего исследования, связано ли появление дополнительных видов GPC, обнаруженных с помощью вестерн-блоттинга, в клетках, инфицированных rJUNV, экспрессирующих Can GPC, аномальной посттрансляционной модификацией Can GPC, мы обработали лизаты инфицированных клеток Vero пептидом-N-гликозидазой F. (PNGase F) для удаления N-связанных гликанов из основной цепи белка. Обработка PNGase F сдвигала белковые полосы промежуточного размера, наблюдаемые в необработанных образцах, в единственную промежуточную полосу (рис. 3А).Антитело против G2, которое мы использовали для вестерн-блоттинга, показало высокую степень неспецифического связывания с PNGase F; однако эта полоса имела более высокую подвижность, чем полосы GPC в необработанных образцах, и не полностью маскировала полосы между необработанными G2 и G1G2 (рис. 3A). Эти результаты показали, что наблюдаемая разница в соотношениях нерасщепленного G1G2 и расщепленного G2 между Rom и Can и связанное с этим присутствие промежуточных полос с накоплением G1G2, вероятно, были вызваны накоплением промежуточных продуктов гликозилирования, созданных при процессинге ER.

Рисунок 3. Состояние N-связанного гликозилирования JUNV GPC. (A) лизатов клеток Vero, инфицированных при MOI 5 либо rRom (Romero), либо rCan (Candid), обрабатывали PNGase F для удаления N-связанных олигосахаридов из основной цепи белка. Профили экспрессии GPC анализировали вестерн-блоттингом с использованием антитела против G2. (B) Активация UPR в клетках HEK 293, экспрессирующих GPC штаммов JUNV, различающихся статусом ослабления in vivo . Клетки трансфицировали равными количествами экспрессионных плазмид для GPC Rom (Romero), Can (Candid), штаммов-предшественников Can XJ13 и XJ44, а также GPC Can и Rom, несущих изменения аминокислот I427F (CanI427F) и F427I (RomF427I). в субъединице G2 и аминокислотные изменения A168T и T168A в субъединице G1 (C) , соответственно.Клеточные лизаты собирали через 24 часа после трансфекции и делили на две равные аликвоты, которые либо обрабатывали имитацией (верхние панели), либо обрабатывали PNGase F (обрабатывали PNGase F). Экспрессию вирусного GPC и маркера UPR BiP анализировали с помощью вестерн-блоттинга. 293, клетки HEK 293, трансфицированные конструкцией, экспрессирующей GFP, которая имеет ту же плазмидную основу, что и конструкции экспрессии для JUNV GPC. Денситометрию рассчитывали с использованием AlphaEase TM , чтобы определить насыщенность каждой полосы.Насыщенность полосы выбранной области представлена ​​по шкале от 0 до 255. (C) Профили экспрессии GPC в клетках с заменой T168A или без нее. Клетки трансфицировали равными количествами каждой плазмиды и инкубировали в течение 36 часов. Клетки HEK 293 трансфицировали плазмидой GFP, содержащей тот же самый остов, что и плазмиды экспрессии GPC. Клетки лизировали и анализировали вестерн-блоттингом.

Can был получен серийным пассированием in vivo, и in vitro, изолята вируса из клинического случая ОСН у человека (Parodi et al., 1958). В ходе этого процесса вирус постепенно терял свою вирулентность для морских свинок, нечеловеческих приматов, мышей и людей (Albariño et al., 2011). Чтобы исследовать, коррелирует ли ослабление Can с эффективностью обработки GPC и посттрансляционных модификаций, мы сгенерировали конструкции экспрессии для Rom и Can GPC, а также двух предшественников Can, XJ13 и XJ44. Мы также создали конструкции, кодирующие Rom GPC, содержащий мутацию F427I в трансмембранной области G2, и Can GPC, содержащий обратную мутацию I427F, чтобы проверить, является ли это положение аминокислоты критическим для нейровирулентности JUNV у мышей (Albariño et al., 2011) и вирулентность у морских свинок (Seregin et al., 2015) также может играть роль в процессинге и посттрансляционном гликозилировании GPCs. С этой целью мы трансфицировали клетки эмбриональной почки человека (HEK) 293 различными конструкциями GPC и исследовали различия в соотношениях G1G2 и G2 и различия в экспрессии промежуточных полос, а также экспрессии BiP, с помощью вестерн-блоттинга (рис. 3B). Примечательно, что эффективность процессинга и паттерн гликозилирования GPCs коррелировали с мутациями, накопленными во время перехода от Rom к Can GPCs (обратите внимание на появление дополнительных полос и повышенную подвижность предшественника G1G2).Чтобы количественно оценить эту разницу, денситометрию проводили с использованием AlphaEase TM . Анализ показал, что расщепленного G2 примерно на 50% больше, чем нерасщепленного G1G2. Это сдвигается к соотношению 2: 1 нерасщепленного G1G2 к расщепленному G2 в XJ13, соотношению 4: 1 нерасщепленного G1G2 к расщепленному G2 в XJ44 и соотношению 2: 1 нерасщепленного G1G2 к расщепленному G2 в Can (рис. 3B). Как и ожидалось, обработка PNGase F привела к исчезновению промежуточных полос в одну единственную полосу. Кроме того, уровни экспрессии BiP также немного увеличиваются в клетках, трансфицированных XJ44 и Can, даже во время сверхэкспрессии плазмиды.Интересно, что присутствие остатков F или I в положении 427 не влияет ни на посттрансляционный процессинг, ни на гликозилирование любого из GPC, ни на уровень экспрессии BiP. В совокупности эти результаты продемонстрировали корреляцию между накоплением нерасщепленного G1G2 и степенью ослабления JUNV in vivo . Незначительное увеличение BiP отличается от значительного увеличения, наблюдаемого при инфекции. Это может быть связано с эффектами сверхэкспрессии белка плазмидой, что приводит к более быстрой экспрессии и накоплению белка, чем то, что могло бы происходить во время инфекции.

Увеличение количества нерасщепленного G1G2 начинается уже в XJ13 GPC, и эти изменения становятся более выраженными в клетках, трансфицированных XJ44 GPC (Рисунок 3B). По сравнению с высокопатогенным штаммом Rom, XJ13 содержит три аминокислотные замены, в то время как только одна единственная дополнительная аминокислотная замена, которая разрушает мотив гликозилирования в N166, произошла между XJ13 и XJ44. Эта единственная мутация (T168A) в области G1 коррелирует с нарушением расщепления GPC (рис. 3B). Чтобы подтвердить, что замены T168A достаточно, чтобы вызвать наблюдаемое нарушение процессинга XJ44 и Can GPC, мы включили эту мутацию в конструкцию экспрессии Rom GPC, а реверсию A168T в конструкцию экспрессии Can GPC.Вестерн-блоттинг показал, что мутация T168A в Rom GPC приводит к соотношению G1G2 к G2, аналогичному тому, которое наблюдается для XJ44 GPC, с лизатом, содержащим преимущественно нерасщепленный G1G2. Реверсия A168T повысила эффективность обработки GPC, что привело к увеличению расщепленного G2 по сравнению с тем, что наблюдается в клетках, трансфицированных Can GPC (рис. 3C). GPC, содержащие мутацию T168A, которая, как было предсказано, отменяет N-связанное гликозилирование по N166, демонстрируют более быструю электрофоретическую миграцию. Это убедительно свидетельствует об отсутствии N-связанного гликана по N166, который в противном случае присутствует в Rom GPC.Интересно, что промежуточные полосы начинают появляться даже в образцах, трансфицированных Rom GPC в системах сверхэкспрессии плазмиды в более поздние моменты времени (36 часов после трансфекции, а не 24 часа после трансфекции), когда белок экспрессируется на более высоких уровнях. чем встречается при заражении (рис. 3С). Это указывает на то, что накопление нерасщепленного G1G2 потенциально способствует присутствию промежуточных полос независимо от присутствия гликана в N166. Вместе эти результаты демонстрируют, что мутация T168A является основной детерминантой уменьшения расщепления G1 / G2 в Can GPC.Присутствие промежуточных полос может указывать на проблему с процессингом и может ассоциироваться с увеличением BiP, и как промежуточные полосы, так и повышающая регуляция BiP появляются в системе сверхэкспрессии независимо от GPC, экспрессируемого в более поздние моменты времени.

Гликопротеины аттенуированных штаммов JUNV накапливаются в эндоплазматическом ретикулуме инфицированных клеток

Увеличение количества нерасщепленного G1G2 в XJ13, XJ44, Can и Rom-T168A GPC-экспрессирующих клетках относительно количества расщепленного G2 привело нас к гипотезе о том, что нерасщепленный G1G2 накапливается в ER.Расщепление G1G2 с помощью SKI-1 / S1P происходит в позднем Гольджи, предполагая, что белок не достигает Гольджи для транспорта на поверхность клетки. Это отношение нерасщепленного G1G2 к расщепленному G2 является наибольшим у XJ44 и Rom-T168A GPC и частично восстанавливается в Can GPC. XJ44 пропускали 19 раз в клетки FRhL, чтобы получить запасы семян для Can. За это время в GPC произошли четыре дополнительных аминокислотных замены (Albarino et al., 2009), которые могли привести к частичному восстановлению процессинга GPC (Рисунок 3).Поэтому мы исследовали, может ли GPC эффективно передаваться от ER к позднему Golgi, где происходит расщепление GPC, или же белок локализуется совместно с ER, с помощью конфокальной микроскопии. Через 24 ч после трансфекции большая часть Rom GPC накапливалась на поверхности клетки, в то время как гораздо более низкие концентрации оставались в ER. Напротив, GP XJ13 были равномерно распределены между ER и поверхностью клетки. Интересно, что GPs, по-видимому, накапливаются в пузырьках в клетках, экспрессирующих XJ13 GPC (Рисунок 4).Хотя идентичность этих пузырьков неясна, мы предполагаем, что они являются частью аппарата Гольджи. Предполагается, что GPC XJ44, Can и RomT168A лишены N-связанного гликана на N166, локализованном в основном с ER, а восстановление мотива гликозилирования в Can GPC (CanA168T) привело к большей концентрации GP на поверхности клетки. Примечательно, что паттерны субклеточного распределения для разных GPs коррелируют с их соответствующими паттернами расщепления GPC (Figure 3). Эти результаты показали, что мутация T168A, которая, по прогнозам, устраняет N-связанный гликан в N166, играет важную роль в удерживании Can GPC в ER, предотвращая достижение Can GP на поверхности клетки.

Рисунок 4. Внутриклеточная локализация JUNV GPC относительно ER и поверхности клетки . Монослои клеток HEK293 трансфицировали управляемыми CMV плазмидами экспрессии, экспрессирующими Romero, XJ13, XJ44, Candid, Romero, экспрессирующими замену T168A (RomT168A), и Candid, экспрессирующими реверсию A168T (CanA168T). Через 36 часов после трансфекции клетки были пермеабилизированы и окрашены как ER-селективным флуоресцентным красителем (красный) и ядерным красителем Hoechst 33342 (синий), так и первичным антителом против JUNV GPC, за которым следовало конъюгированное вторичное антитело AlexaFluor TM . (зеленый).Клетки получали с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM 510. Включены как объединенные изображения на одной плоскости Z (слева), так и поперечное сечение одной репрезентативной ячейки по оси Z (справа).

Гликопротеины вирулентного рома, но не аттенуированные XJ13, XJ44 и могут эффективно экспрессироваться на поверхности клетки

Поскольку мутация T168A предположительно вызвала отсутствие N-связанного гликана в N166 и удержание GP в ER, мы предположили, что GP JUNV, содержащие мутацию T168A, будут демонстрировать сниженную экспрессию на клеточной поверхности.Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали проточную цитометрию для количественной оценки уровней GP на поверхности клетки для каждой из наших конструкций GPC (рисунок S1). Мы разделили образцы на две отдельные аликвоты, обеспечив проницаемость только одной из аликвот. Непроницаемые образцы позволили нам количественно определить GP, присутствующие на поверхности клетки (рис. 5Ai). Клетки, трансфицированные Rom GPC, экспрессировали самые высокие уровни GP на клеточной поверхности, и мы наблюдали снижение градиента экспрессии на поверхности GPC клеток от XJ13 к XJ44 и клеткам, трансфицированным Can GPC.Кроме того, мы наблюдали значительное снижение поверхностной экспрессии GP, когда мотив гликозилирования G1 N166 был удален из Rom GPC. Точно так же мы смогли спасти поверхностную экспрессию Can GP, ​​восстановив остаток Т в положении 168 (рис. 5Ai). Мы рассчитали процент GPC, экспрессируемого на поверхности клеток, по отношению к общему количеству GPC из проницаемых клеток и сравнили образцы. И XJ44, и Can GPC показывают снижение процента поверхностной экспрессии по сравнению с Rom GPC (рис. 5Aii).Эти результаты показали, что Rom GPC эффективно достигают клеточной поверхности, в то время как устойчивое снижение экспрессии на клеточной поверхности наблюдается в клетках, трансфицированных XJ13, XJ44 и Can GPC. Экспрессия GPC, содержащих мутацию T168A, привела к тому, что только небольшая часть GPC достигла поверхности клетки по сравнению с Rom GPC. Однако снижение поверхностной экспрессии RomT168A более прямо связано с более низкой экспрессией общего белка, несмотря на одинаковую трансфекцию плазмиды.

Рисунок 5.Экспрессия JUNV GPC на клеточной поверхности. Монослои клеток HEK293 трансфицировали плазмидами для экспрессии, управляемыми CMV, которые ранее использовали в трех повторностях (фиг. 4). Через 24 часа после трансфекции клетки ресуспендировали и фиксировали 4% параформальдегидом. Клетки были разделены на две отдельные аликвоты для каждого образца, и одна аликвота была проницаема с помощью Triton-X100, а другая оставалась необработанной. Повторно суспендированные клетки окрашивали первичным антителом против JUNP GPC, а затем окрашивали вторичным антителом, конъюгированным с APC.Взвешенные клетки подвергали проточной цитометрии. (Ai) Гистограмма, представляющая среднюю интенсивность флуоресцентно-положительных клеток, необработанных Тритоном-Х100, выраженная в единицах флуоресценции, полученных от индивидуальных клеток. Клетки с положительной флуоресценцией регистрировали на основе флуоресценции контрольной группы HEK293 с ложной трансфекцией. Показаны средние значения интенсивности трех отдельных экспериментов (столбцы) и стандартная ошибка для трех повторов (линии). (Aii) Гистограмма, представляющая процент клеток, экспрессируемых на клеточной поверхности.Аликвоты, обработанные Triton-X100, окрашивали таким же образом, как (Ai) , и измеряли среднюю интенсивность флуоресценции путем сортировки клеток. Результаты (Ai) были разделены на полученные значения для общего белка. Показаны средние проценты (столбцы, выраженные в виде десятичных значений) и стандартная ошибка для трех повторов.

Обсуждение

Механизмы, ответственные за аттенуацию штамма Can вируса JUNV, который в настоящее время используется в качестве живой аттенуированной вакцины в эндемичных по AHF регионах Аргентины (Ambrosio et al., 2011), еще предстоит выяснить. Предыдущие исследования продемонстрировали, что изменение одной аминокислоты (F427I) в трансмембранной области субъединицы G2 гликопротеинового комплекса оболочки значительно ослабляет нейровирулентность JUNV у мышей (Albariño et al., 2011). Эта единственная замена была предложена для дестабилизации метастабильной конформации гликопротеинового комплекса, способствуя его переходу в фузогенную конформацию при нейтральном pH и, возможно, ограничивая распространение вируса (Droniou-Bonzom et al., 2011). Однако внутрибрюшинная инокуляция морских свинок rRom, содержащим замену F427I, привела к самоограничивающемуся острому заболеванию, предполагая, что мутация F427I в G2 может лишь частично объяснять сильно ослабленный фенотип Can in vivo (Серегин и др., 2015). Более того, мутация F427I была зафиксирована в геноме JUNV на заключительных этапах создания вакцины Can во время пассажей в клетках FRhL-2 и после того, как вирус уже достиг ослабления у морских свинок и нечеловеческих приматов (Ambrosio et al., 2011). Это дополнительно указывает на то, что другие мутации в GPC также важны для ослабления Can. В соответствии с этими находками только rJUNV, экспрессирующие полноразмерный GPC Can, были полностью аттенуированы и не индуцировали никаких выявляемых симптомов заболевания в модели AHF на морских свинках (Seregin et al., 2015). Интересно, что гликопротеиновый комплекс Can показал повышенную зависимость от TfR-1 для входа в клетку-мишень (Droniou-Bonzom et al., 2011), а рецептор-связывающий домен был картирован в субъединице G1 (Nunberg and York, 2012). ; Buchmeier et al., 2013). Следовательно, роль других молекулярных механизмов, отличных от тех, которые связаны с изменением аминокислоты F427I в G2, в ослаблении JUNV должны быть исследованы. Среди дополнительных мутаций — одна аминокислотная замена, которая произошла между XJ13 и XJ44 (T168A), которая устраняет мотив N-связанного гликозилирования, присутствующий в G1 (Albarino et al., 2009).

Can и Rom GP демонстрировали отчетливо разные отношения G1G2 к G2, которые были обнаружены Western, а также различия в эффективности процессинга GPC, характеризуемые в первую очередь увеличением нерасщепленного G1G2 и связанным с этим присутствием промежуточных полос в Can GPC (рис. ).Обработка PNGase F перед вестерн-блоттингом привела к обнаружению только видов GPC и G2 и коллапсу двух промежуточных полос в одну полосу (рис. 3), подтверждая, что промежуточные полосы GP соответствуют увеличению нерасщепленного G1G2, и содержат различные профили гликозилирования. Интересно, что наличие промежуточных полос не коррелирует с наличием специфических мутаций, а скорее с накоплением нерасщепленного G1G2 в клетках. Это подтверждается наличием промежуточной полосы, созданной Rom GPC во время сверхэкспрессии плазмиды в течение 36 часов.В этот более поздний момент времени даже Rom GPC начал накапливать нерасщепленный G1G2 в трансфицированных клетках, несмотря на сохранение его уровней расщепленного G2. Более быстрая миграция GPC как из XJ44, так и из Can (фиг. 3) коррелировала с присутствием мутации T168A, которая, как предполагается, удаляет мотив N-связанного гликозилирования из N166-T168. Аномальный профиль гликозилирования XJ44 и Can может приводить к накоплению неправильно свернутых белков в ER, что может запускать клеточный ответ на стресс ER.В соответствии с этой возможностью мы наблюдали повышенные уровни экспрессии BiP в клетках, инфицированных вирусами, экспрессирующими Can GPC (рис. 2А). Однако клетки, трансфицированные либо Rom, либо Can GPC, не проявляют столь выраженных различий в экспрессии BiP. Мы полагаем, что это происходит из-за чрезмерной экспрессии плазмиды в этих клетках, где оба белка экспрессируются на уровнях, намного превышающих уровни, наблюдаемые во время инфекции, что приводит к аналогичной экспрессии BiP. Шаперон ER BiP является первичным детектором стресса ER и отвечает за активацию трех основных ветвей UPR посредством медиаторов IRE1, PERK и ATF6 (Schroder, 2008).Временная повышающая регуляция BiP была также обнаружена в клетках, инфицированных LCMV (Pasqual et al., 2011). Устойчивый UPR из-за неспособности своевременно разрешить накопление неправильно свернутых белков в ER, вызовет апоптоз клеток (Schroder, 2008), ситуацию, которая была описана при ряде вирусных инфекций (Dimcheff et al., 2004; Medigeshi et al. , 2007; Barry et al., 2010). Было описано, что апоптоз чаще встречается в Can-инфицированных клетках, чем в Rom-инфицированных (Kolokoltsova et al., 2014), это открытие согласуется с нашими результатами, документально подтверждающими повышенные уровни BiP и расщепленных каспаз (Рисунок 2).Корреляция между ослаблением и UPR-ассоциированной проапоптотической передачей сигналов указывает на то, что неправильный процессинг Can GPC может вносить вклад в защитный иммунный ответ посредством активации провоспалительных генов (Zhang and Kaufman, 2008).

Предполагается, что мутация T168A разрушает мотив N-связанного гликозилирования из N166-T168. Эта мутация возникла до XJ44 и коррелировала с серьезным нарушением процессинга GPC. Во время последующих пассажей XJ44 в клетках FRhL для образования Can вирус приобрел четыре дополнительных аминокислотных замены (Ambrosio et al., 2011), что приводит к частичному восстановлению расщепления GPC и переносу GP на поверхность клетки (рис. 3C). Поэтому мы подозревали, что мутация T168A была основным фактором нарушенного и аномального процессинга Can GPC. Результаты включения замен T168A и A168T в плазмиды, экспрессирующие Rom и Can GPC, соответственно, подтверждают эту гипотезу (рис. 3C). Мы наблюдали, что комбинированная экспрессия всех видов GP, полученных из GPC, содержащего 168A, была ниже, чем наблюдаемая для GPC, содержащего 168T.Основываясь на доказательствах активации UPR в клетках, экспрессирующих GPC с дефицитом мотива гликозилирования, мы подозреваем, что причина снижения общего GP может быть связана с ER-ассоциированной деградацией (ERAD), запускаемой аномальным гликозилированием GPC 168A ( Вембар, Бродский, 2008).

И XJ44, и Can GPC продемонстрировали ухудшение обработки GPC по сравнению с Rom GPC (рисунок 3). Расщепление GPC на G1 и G2 с помощью SKI-1 / S1P не происходит до тех пор, пока GPC не достигнет Golgi (Lenz et al., 2001; Beyer et al., 2003). Конфокальная микроскопия показала, что GPC, содержащий мутацию T168A, локализован в основном с маркерами ER в трансфецированных клетках, что подтверждает гипотезу о том, что расщепление GPC нарушается из-за удержания GPC в ER. Хотя мы не можем исключить возможность того, что GPC не может быть расщеплен из-за присущей ему проблемы сворачивания, которая делает недоступным мотив расщепления, вестерн-блот-анализ показал, что часть Can GPC все еще была расщеплена (Рисунки 2, 3). Кроме того, отношения нерасщепленного G1G2 к расщепленному GPC, присутствующие в анализе вестерн-блоттинга (рис. 3B), грубо коррелируют с долями общего GPC, присутствующего на поверхности клеток для Rom, XJ13, XJ44 и Can (рис. 5Aii).Хотя мы описываем значительную разницу в экспрессии белка между Rom и Can GPC на поверхности клетки, концентрация GPC, необходимая для успешного инфицирования клеток-мишеней in vitro , остается неясной, поскольку вирусы Rom и Can не демонстрируют значительных различий в продукции инфекционных частиц в клетках. культура (Серегин и др., 2015). Снижение концентрации GPC на поверхности клетки, вероятно, повлияет на концентрацию GPC на вирусных частицах, и хотя это, по-видимому, не влияет на инфекционность в культуре клеток, может быть значительный эффект на инфекционность вируса in vivo .Штамм LCMV с модифицированным сайтом расщепления G1G2 (Clone 13 FURIN ), как было ранее показано, ослаблен, несмотря на аналогичный рост in vitro (Popkin et al., 2011). И Rom GPC, несущий единственную замену T168A, и XJ13 GPC экспрессировали промежуточные уровни GP на поверхности клетки по сравнению с Rom и XJ44 GPC, что указывает на то, что другие аминокислотные замены, присутствующие в XJ13, также способствовали неправильному перемещению GP XJ13 в клетку. поверхность. Интересно, что XJ13 GP, по-видимому, накапливается в небольших пузырьках между ER и поверхностью клетки.Хотя идентичность этих пузырьков не выяснена, мы подозреваем, что это пузырьки Гольджи. Существуют дополнительные этапы обрезки N-связанного гликозилирования и контроля качества, которые проводятся в Golgi (Arvan et al., 2002), и возможно, что одна или обе аминокислотные замены, присутствующие в XJ13 G1, повлияли на обработку и сортировку. GP XJ13 во время контроля качества Гольджи.

Пониженные уровни экспрессии комплекса Can GP на поверхности клетки (рис. 5) могли способствовать снижению внутриклеточных уровней белка Z в инфицированных клетках, экспрессирующих Can GPC (рис. 2А).Белок Z взаимодействует с комплексом GP, чтобы обеспечить его включение в почкующийся вирион (Capul et al., 2007; Schlie et al., 2010). Было показано, что отпочкование JUNV Z из клетки не требует присутствия др. Вирусных белков (Perez et al., 2003). Следовательно, возможно, что Z-белок отрастает независимо от комплекса Can GP. Эта гипотеза подтверждается тем фактом, что высвобождение Z из клетки ингибируется совместной экспрессией GPC (Groseth et al., 2010). Этот феномен независимого Z-зачатия может также помочь объяснить различия, наблюдаемые в экспрессии РНК между rJUNVs. Увеличение РНК в ослабленных вирусах также сильно коррелирует с отсутствием Z в инфицированных клетках. Белок Z является ингибитором LP, и отсутствие белка Z привело бы к более высокой активности полимеразы в инфицированных клетках.

В совокупности наши результаты подтверждают вывод, что Can GPC вызывает стресс ER посредством неправильной пост-трансляционной обработки и удержания вирусного GP в ER.Механизм удержания GP внутри ER и то, как это способствует ослаблению живой вакцины, еще предстоит выяснить.

Авторские взносы

JM и AS в равной степени внесли свой вклад в концепцию и дизайн экспериментов и имеют первое авторство рукописи. Нью-Йорк помогал в спасении и размножении всех рекомбинантных вирусов, а также в сборе РНК и клеточных лизатов для вестерн- и нозерн-блоттинга. ТК помог с проточной цитометрией. NY, CH, JB, TK, Jd и SP помогли JM и AS с анализом данных и интерпретацией результатов.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

AS был поддержан программой обучения биозащите, грант NIH T32-AI060549. JM получил стипендию от Центра разработки вакцин Сили. Это исследование было поддержано грантом службы общественного здравоохранения R01AI093445, предоставленным SP и Jd.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fcimb.2017.00020/full#supplementary-material

Рисунок S1. Количественное определение поверхностных и общих клеток проточной цитометрией GPC . Клетки HEK293 трансфицировали плазмидами экспрессии GPC, управляемыми CMV, в трех повторностях. Через 24 часа после трансфекции клетки ресуспендировали и фиксировали 4% параформальдегидом. Клетки были разделены на две отдельные аликвоты для каждого образца, и одна аликвота была проницаема с помощью Triton-X100, а другая оставалась необработанной.Повторно суспендированные клетки окрашивали первичным антителом против JUNP GPC, а затем окрашивали вторичным антителом, конъюгированным с APC. Взвешенные клетки подвергали проточной цитометрии. (Ай) . Интенсивность флуоресценции каждой клетки без обработки Triton-X100, представляющая экспрессию GPC на поверхности. Полоса представляет собой популяцию положительных клеток. (Aii) . Интенсивности флуоресценции каждой клетки при обработке Triton-X100, представляющие общий клеточный GPC.Полоса представляет собой популяцию положительных клеток.

Список литературы

Альбарино, К. Г., Бержерон, Э., Эриксон, Б. Р., Христова, М. Л., Роллин, П. Э. и Никол, С. Т. (2009). Эффективная обратная генетика генерации инфекционных вирусов юнина, различающихся процессингом гликопротеина. J. Virol. 83, 5606–5614. DOI: 10.1128 / JVI.00276-09

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Альбариньо, К. Г., Берд, Б. Х., Чакрабарти, А. К., Додд, К.А., Флинт, М., Бержерон, Э., и др. (2011). Основной детерминант ослабления вакцины против аргентинской геморрагической лихорадки Candida у мышей находится в трансмембранном домене гликопротеина G2. J. Virol. 85, 10404–10408. DOI: 10.1128 / JVI.00856-11

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Амбросио, А., Сааведра, М., Мариани, М., Гамбоа, Г., и Майза, А. (2011). Вакцины против аргентинской геморрагической лихорадки. Hum. Вакцин. 7, 694–700.DOI: 10.4161 / hv.7.6.15198

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Арван П., Чжао Х., Рамос-Кастанеда Дж. И Чанг А. (2002). Контроль качества секреторных путей в системах Гольджи, плазмалеммы и эндосомах. Трафик 3, 771–780. DOI: 10.1034 / j.1600-0854.2002.31102.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Барри Г., Фрагкудис Р., Фергюсон М. К., Лулла А., Меритс А., Коль А. и др.(2010). Стресс эндоплазматического ретикулума, вызванный вирусом леса Семлики, ускоряет апоптотическую гибель клеток млекопитающих. J. Virol. 84, 7369–7377. DOI: 10.1128 / JVI.02310-09

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бейер, В. Р., Пёпплау, Д., Гартен, В., фон Лаер, Д., и Ленц, О. (2003). Эндопротеолитический процессинг гликопротеина вируса лимфоцитарного хориоменингита субтилазой SKI-1 / S1P. J. Virol. 77, 2866–2872. DOI: 10.1128 / JVI.77.5.2866-2872.2003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бухмайер, М. Дж., Де ла Торре, Дж. К., и Петерс, К. Дж. (2013). Arenaviridae, в: Knipe, D.M., Holey, P.M. (Eds.), Fields Virology, шестое издание, стр. . 1283–1303.

Капул, А. А., Перес, М., Берк, Э., Кунц, С., Бухмайер, М. Дж., И де ла Торре, Дж. К. (2007). Ассоциация Z-гликопротеина аренавируса требует Z-миристоилирования, но не функционального RING или поздних доменов. Дж.Virol. 81, 9451–9460. DOI: 10.1128 / JVI.00499-07

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Корню, Т. И., и де ла Торре, Дж. К. (2001). Белок Z RING finger вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV) ингибирует транскрипцию и репликацию РНК минигенома S-сегмента LCMV. J. Virol. 75, 9415–9426. DOI: 10.1128 / JVI.75.19.9415-9426.2001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Димчефф, Д.Э., Фаасс, М. А., МакЭти, Ф. Дж., И Портис, Дж. Л. (2004). Стресс эндоплазматического ретикулума (ER), индуцированный нейровирулентным ретровирусом мыши, связан с пролонгированным связыванием BiP и удержанием вирусного белка в ER. J. Biol. Chem. 279, 33782–33790. DOI: 10.1074 / jbc.M403304200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дрониу-Бонзом, М. Э., Ренье, Т., Ольденбург, Дж. Э., Кокс, А. У., Экслайн, К. М., Ратбун, Дж. Ю. и др. (2011). Замены в гликопротеине (GP) вакцинного штамма Candid # 1 вируса Хунин увеличивают зависимость от рецептора 1 трансферрина человека для входа и дестабилизируют метастабильную конформацию GP. J. Virol. 85, 13457–13462. DOI: 10.1128 / JVI.05616-11

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эмонет С.Ф., Серегин А.В., Юн Н.Э., Пуссар А.Л., Уокер А.Г., де ла Торре, Дж. К. и др. (2011). Спасение от клонированных кДНК и in vivo. характеристика рекомбинантных патогенных штаммов Romero и живых аттенуированных штаммов Candid # 1 вируса Junin, возбудителя аргентинской геморрагической лихорадки. J. Virol. 85, 1473–1483.DOI: 10.1128 / JVI.02102-10

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грозет, А., Вольф, С., Стрекер, Т., Хоенен, Т., и Беккер, С. (2010). Для эффективного отпочкования матричного белка z вируса такарибе необходим нуклеопротеин. J. Virol. 84, 3603–3611. DOI: 10.1128 / JVI.02429-09

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Колокольцова, О.А., Грант, А.М., Хуанг, К., Смит, Дж. К., Пуссар, А. Л., Тиан, Б., и другие. (2014). RIG-I усиливал интерферон-независимый апоптоз при инфицировании вирусом Хунин. PLoS ONE 9: e99610. DOI: 10.1371 / journal.pone.0099610

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Kranzusch, P.J., Schenk, A.D., Rahmeh, A.A., Radoshitzky, S.R., Bavari, S., Walz, T., et al. (2010). Сборка функционального комплекса вирусной полимеразы Мачупо. Proc. Natl. Акад. Sci. 107, 20069–20074. DOI: 10.1073 / pnas.1007152107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кранцуш, П.Дж., И Уилан, С. П. Дж. (2011). Белок аренавируса Z контролирует синтез вирусной РНК, блокируя комплекс полимераза-промотор. Proc. Natl. Акад. Sci. 108, 19743–19748. DOI: 10.1073 / pnas.1112742108

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, К. Дж., Новелла, И. С., Тенг, М. Н., Олдстон, М. Б., и де Ла Торре, Дж. К. (2000). Белки NP и L вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV) достаточны для эффективной транскрипции и репликации аналогов геномной РНК LCMV. J. Virol. 74, 3470–3477. DOI: 10.1128 / JVI.74.8.3470-3477.2000

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ленц, О., тер Меулен, Дж., Кленк, Х. Д., Сейда, Н. Г., и Гартен, В. (2001). Гликопротеин-предшественник вируса Ласса GP-C протеолитически процессируется субтилазой SKI-1 / S1P. Proc. Natl. Акад. Sci. США 98, 12701–12705. DOI: 10.1073 / pnas.221447598

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю, К.Ю., Сюй, З., и Кауфман, Р. Дж. (2003). Структура и межмолекулярные взаимодействия люминального домена димеризации IRE1α человека. J. Biol. Chem. 278, 17680–17687. DOI: 10.1074 / jbc.M300418200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Медигеши, Г. Р., Ланкастер, А. М., Хирш, А. Дж., Бризе, Т., Липкин, В. И., Дефилиппис, В., и др. (2007). Инфекция вируса Западного Нила активирует ответ развернутого белка, что приводит к индукции CHOP и апоптозу. J. Virol. 81, 10849–10860. DOI: 10.1128 / JVI.01151-07

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Parodi, A. S., Greenway, D. J., Rugiero, H. R., Frigerio, M., de la Barrera, J. M., Mettler, N., et al. (1958). [О вспышке эпидемии в Хунине]. Dia Med. 30, 2300–2301.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Паскуаль, Г., Бурри, Д. Дж., Паскуато, А., де ла Торре, Дж. К., и Кунц, С. (2011). Роль развернутого белкового ответа клетки-хозяина в аренавирусной инфекции. J. Virol. 85, 1662–1670. DOI: 10.1128 / JVI.01782-10

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Перес М., Крейвен Р. К. и де ла Торре Дж. К. (2003). Малый белок Z пальца RING управляет почкованием аренавируса: значение для противовирусных стратегий. Proc. Natl. Акад. Sci. США 100, 12978–12983. DOI: 10.1073 / pnas.2133782100

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Попкин Д. Л., Тейджаро Дж.R., Sullivan, B.M., Urata, S., Rutschmann, S., de la Torre, J.C., et al. (2011). Гипоморфная мутация протеазы сайта 1 Mbtps1 придает устойчивость к стойкой вирусной инфекции клеточно-специфическим образом. Клеточный микроб-хозяин 9, 212–222. DOI: 10.1016 / j.chom.2011.02.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шли К., Стрекер Т. и Гартен В. (2010). Расщепление при созревании внутри эктодомена гликопротеина вируса Ласса зависит от стабилизации цитоплазматическим хвостом. FEBS Lett. 584, 4379–4382. DOI: 10.1016 / j.febslet.2010.09.032

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Серегин, А.В., Юн, Н.Э., Миллер, М., Аронсон, Дж., Смит, Дж. К., Уокер, А. Г. и др. (2015). Ген-предшественник гликопротеина вируса Хунин определяет вирулентность штамма Romero и ослабление штамма Candid 1 в репрезентативной модели аргентинской геморрагической лихорадки на животных. J. Virol. 89, 5949–5956. DOI: 10.1128 / JVI.00104-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Юн, Н. Е., Линде, Н. С., Дзюба, Н., Закс, М. А., Смит, Дж. Н., Смит, Дж. К. и др. (2008). Патогенез штаммов XJ и Romero вируса Junin у двух штаммов морских свинок. Am. J. Trop. Med. Hyg. 79, 275–282.

PubMed Аннотация | Google Scholar

кандидатов — Публичная библиотека округа Кайахога

Foundation Center и GuideStar объединили свои таланты, технологии, данные и лидерство, чтобы сформировать Candid .

Ежегодно миллионы некоммерческих организаций тратят триллионы долларов по всему миру. Candid выясняет, откуда берутся эти деньги, куда они уходят и почему это важно. Посредством исследований, сотрудничества и обучения Candid соединяет людей, которые хотят изменить мир, с ресурсами, которые им необходимы для этого. Инструменты Candid для работы с данными о некоммерческих организациях, фондах и грантах являются наиболее полными в мире.

Candid предоставит вам информацию, необходимую для добрых дел

Публичная библиотека округа Кайахога, являясь членом общенациональной сети некоммерческих организаций Candid , предоставляет посетителям бесплатный публичный доступ к электронным базам данных и ресурсам Candid в нашем отделении Berea Branch .

Candid позволяет вам получить доступ к базе данных Foundation Directory Online , Grants to Individuals Online и другим ресурсам для поддержки и укрепления вашей некоммерческой организации в нашем Berea Branch в любое время в течение часов работы .

Foundation Directory Online (FDO) — это база данных Candid по сбору средств, которая дает соискателям грантов беспрецедентный доступ к самому большому количеству чистых и закодированных данных о благотворительности, которые существуют в настоящее время.Сочетая исчерпывающие данные с интуитивно понятной функцией поиска и информативной визуализацией данных, FDO делает сбор средств быстрым и эффективным. Посетите наш Berea Branch , чтобы получить доступ к этому ресурсу. Просмотрите то, что вы найдете, просмотрев этот веб-семинар — Введение в Foundation Directory Online .

Гранты частным лицам : Candid дает вам доступ к подробной информации о более чем 10 000 фондов, которые предоставляют гранты или стипендии физическим лицам.Посетите наш Berea Branch , чтобы получить доступ к этому ресурсу.

Submissive Volume 1: Откровенные интервью с 20 образными Submissive

«Submissive Volume 1» — обязательное чтение для всех женщин, желающих изучить свою сабмиссивную сторону. В этой книге есть места, которые удивят одних и, возможно, шокируют других, поскольку она всегда откровенна. 20 выбранных здесь интервью были проведены в течение 10 лет издателем и писателем журнала BDSM Роем Тернером и предлагают полное, откровенное и совершенно уникальное понимание реального мира сабмиссива.

Это определенно не какой-то фэнтези-фест Э.Л. Джеймса «Пятьдесят оттенков серого» или Нэнси Фрайдей, и т. Д., Он показывает, что эти стереотипы — если они вообще существуют, то совсем не репрезентативны об опыте, описанном здесь. Как и ее коллега-мужчина, покорная женщина бывает всех типов; довольно часто она может быть очень успешной карьерной женщиной в «реальной» жизни, которая просто жаждет случайного освобождения от ответственности, которая достигается через ролевые игры, или женщиной, которая на все 100% бросается в этот образ жизни.Также существовала тенденция отделять «мужей / любовников» от «мастеров» и вести двойную жизнь с ведома или согласия своего партнера или без него. Но есть также и более темная сторона, которую не так часто можно найти в мужском сабмиссиве; действительно опасная область, в которую охотно вступают некоторые женщины.

Эти женщины определенно «ходят по разговору»; будь то экстремальная ролевая игра, дрессировка раба, девочка-пони, принудительное рабство и проституция, похищение или даже похищение. Следовательно, некоторые из описанных здесь переживаний можно было считать чрезвычайно шокирующими и по-настоящему тревожными.Это точно не для слабонервных!

Для многих респондентов потребность в доминировании уходит корнями, что неудивительно, в детство. Авторитарный, даже жестокий отец, который пошел дальше случайных порок и т. Д., Положил начало тенденции, которую они стремились воссоздать в будущих отношениях. Но другие испытуемые оказались инстинктивно привлечены к этому по причинам, менее объяснимым, конечно, не из-за заниженной самооценки или чего-то столь очевидного. Во многих рассказанных историях граница между контролируемым и контролирующим становится размытой, другими словами, так называемый сабмиссив на самом деле направляет сценарий.Безусловно, наиболее популярным и действенным сценарием для большинства женщин была идея, что их используют двое или более мужчин, при этом полное унижение и унижение часто являются ключевыми факторами.

Взгляните на себя и воспользуйтесь функцией «Загляните внутрь» и прочтите бесплатный образец книги…

Примечание издателя: эта электронная книга содержит откровенно сексуальный контент, графические выражения и ситуации, которые некоторые читатели могут найти нежелательными. Он предназначен для взрослой аудитории.

1% лосьон Candid — использование, дозировка, побочные эффекты, цена, преимущества, интернет-аптеки

Описание

{«1»: 2, «2»: «Лосьон Candid чрезвычайно эффективен при лечении грибковых инфекций кожи и ушей. .Присутствует противогрибковое средство клотримазол. С его помощью можно эффективно лечить стригущий лишай, сыпь от подгузников, микоз, вагинальный молочница и сыпь от пота. Поскольку он атакует клеточную мембрану грибка, регулярное нанесение лосьона эффективно убивает грибки. Лосьон предназначен только для наружного применения и должен использоваться только под наблюдением врача. Если вы используете больше рекомендованной дозы, у вас могут возникнуть побочные эффекты, такие как отек, волдыри, раздражение и т. Д. Если инфекция не исчезнет через 4 недели, несмотря на использование лосьона Candid Lotion, обратитесь к врачу.После заживления раны держите пораженный участок чистым и сухим, чтобы избежать повторного заражения. \ N \ n \ n \ nПреимущества \ nКандидозный лосьон — это противогрибковое лекарство, используемое для лечения грибковых инфекций. \ NКлотримазол, противогрибковый агент, присутствует. \ NПрисутствуют грибки. убивает путем атаки и разрушения клеточных мембран. \ n \ n \ nКлотримазол IP 1 процент на неводной основе включен в ингредиенты. \ n \ n \ n \ nЛечит грибковые инфекции кожи, такие как стригущий лишай, стопы спортсменов, грибковые опрелости и ушные инфекции. \ n \ n \ n \ nКак применять \ nПри использовании лосьона Candid следуйте инструкциям врача.\ nЕсли вы используете лекарство на ногах. Перед нанесением лосьона вымойте и высушите ноги, уделяя особое внимание промежуткам между пальцами ног. \ NВ случае кожной инфекции равномерно наносите лосьон на пораженный участок два или три раза в день. \ NДаже при появлении симптомов. инфекции утихли, продолжайте наносить лосьон в течение как минимум двух недель. \ nЕсли у вас аллергия на клотримазол, вы беременны или кормите грудью, проконсультируйтесь с врачом перед использованием этого лосьона. \ nТакже сообщите своему врачу, если вы в настоящее время используете другой актуальные лекарства.\ n \ n \ nИнформация о безопасности \ nДержите его в недоступном для детей месте. \ nДержите вдали от света и в прохладном, сухом месте. Храните его при комнатной температуре (15-25 градусов Цельсия). \ NНе используйте лосьон по истечении срока его годности. «}» Data-sheet-userformat = «{» 2 «: 769,» 3 «: {» 1 «: 0}, «11»: 0, «12»: 0} «data-mce-fragment =» 1 «> Показания:
Лечит грибковые инфекции кожи, такие как стригущий лишай, стопы спортсменов, грибковые опрелости и ушные инфекции.

Applications:
Следуйте инструкциям врача при использовании лосьона Candid.
Если вы используете лекарство на ногах. Перед нанесением лосьона вымойте и высушите ноги, уделяя особое внимание промежуткам между пальцами ног.
В случае кожной инфекции равномерно наносите лосьон на пораженный участок два или три раза в день.
Даже если симптомы инфекции исчезли, продолжайте наносить лосьон не менее двух недель.
Если у вас аллергия на клотримазол, вы беременны или кормите грудью, проконсультируйтесь с врачом перед использованием этого лосьона.
Также сообщите своему врачу, если вы в настоящее время принимаете другое лекарство для местного применения.

Информация о безопасности:
Хранить в недоступном для детей месте.
Хранить вдали от света и в прохладном сухом месте. Хранить при комнатной температуре (15-25 градусов Цельсия).
Не используйте лосьон по истечении его срока годности.

Последнее обновление информации:: Пт, 12 ноября 2021 г., 17:54:16 GMT + 0800 (время Малайзии)

Представленные изображения продуктов приведены только в целях иллюстрации и могут не являться точным представлением продукта

Предоставленное содержание на этой веб-странице предназначена только для предоставления информации, которая должна быть полностью интерпретирована медицинским работником и не предназначена в качестве руководства для принятия решений о покупке или замены совета медицинского специалиста.Эффективность и побочные эффекты лекарств могут отличаться от человека к человеку. Мы не поощряем клиентов к самостоятельной диагностике и / или самолечению. Пациенты всегда должны проконсультироваться с врачом, прежде чем принимать или использовать какие-либо лекарства. Представленное здесь содержание не является исчерпывающим и может не охватывать все аспекты лечения. Наш сервис следует использовать только для поддержки взаимоотношений между врачом и пациентом, а не для его замены.

Выполнение рецептурных лекарств зависит от нашего рецепта, выданного врачом, зарегистрированным в Медицинском совете Малайзии (MMC).При необходимости мы предоставим телеконсультации с одним из наших зарегистрированных врачей. Это не реклама лекарства, поскольку такая реклама требует предварительного одобрения Совета по рекламе лекарств Малайзии.

1% лосьон Candid доступен во многих регионах Малайзии. Куала-Лумпур, Букит Бинтанг, Титивангса, Сетиавангса, Ванса Маджу, Кепонг, Сегамбут, Бандар Тун Разак, Черас, Субанг Джая, Петалинг Джая, Монт Киара, Пучонг, Бандар Сануэй, TTDI, Сери Кембанган, Кланг, Дамулсара Тингги , Пенанг, Джорджтаун, Джелутонг, Гелугор, Баян Бару, Бандар Бару Эйр Итам, Сунгай Ара, Букит Мертаджам, Баттерворт, Пераи, Джохор-Бару, Скудаи, Букит Индах, Геланг Патах, Сенай, Пасир Гуданг, Таман Дайя, Таман Молек, Таман Перлинг, Тебрау, Данга Бэй, Ларкин, Нусаджая, Понтиан, Масаи, Сети Тропика, Десару, Тампой.

Лосьон Candid 1% Lotion продается во многих местах Сингапура. Анг Мо Кио, Александра, Адмиралтейство, Бедок, Бишан, Букит Баток, Букит Мера, Букит Панджанг, Букит Тимах, Боут Ки, Буона Виста, Бич Роуд, Бугис, Балестиер, Бун Лей, Центральный район, Чоа Чу Канг, Клементи, Чайнатаун , Commonwealt, City Hall, Clarke Quay, аэропорт Changi, Changi Village, Clementi Park, Dairy Farm, Eunos, East Coast, Farrer Park, Geylang, Hougang, Harbourfront, Holland, Jurong, Jurong East, Jurong West, Kallang / Whampoa, Lim Чу Канг, Морской парад, Марина, Макферсон, Мандай, Ньютон, Новена, Фруктовый сад, Пасир Рис, Пунггол, Потонг Пасир, Пайя Лебар, Квинстаун, Raffles Place, Рочор, Долина реки, Сембаванг, Сенгканг, Серангун, Серангун-роуд, Селетар, Тампинс, Тоа Пайох, Танджонг Пагар, Телок Бланга, Танглин, Томсон, Туас, Тенгах, Верхнее восточное побережье, Верхний Букит Тимах, Аппер Томсон, Вудлендс, Западное побережье, Ишун, Ио Чу Канг.

Заявление об ограничении ответственности См. Меньше

Candid — MacArthur Foundation

2020 • 2 года

Candid был создан в 2019 году в результате слияния Foundation Center и GuideStar, чтобы стать наиболее полным источником информации о фондах, некоммерческих организациях, корпоративных пожертвованиях, оценке и связанных темах.Candid обслуживает миллионы грантодателей, соискателей грантов, исследователей, политиков, журналистов и представителей широкой общественности через свои библиотеки, публикации, базы данных, архивы и образовательные службы. Этот грант обеспечивает Candid гибкой поддержкой общих операций.

2017 • 3 года

Центр фондов (Центр) является исчерпывающим источником информации о фондах, некоммерческих организациях, благотворительных организациях, оценках и связанных с ними предметах и ​​обслуживает миллионы грантодателей, соискателей грантов, исследователей, политиков, журналистов и членов общественных организаций. общественности через свои библиотеки, публикации, базы данных, архивы и образовательные службы.

Эта награда обеспечивает общую поддержку Центру и дополняет грант на проект Центру для работы над предложениями «100 и изменения», который также действует до мая 2018 года. Эта награда укрепляет и расширяет информационную инфраструктуру, используемую миллионами людей и других лиц. коммерческих организаций по всему миру и поддерживает десятки тысяч фондов в их стремлении быть более прозрачными и эффективными.

2017 • 1 год • 100 и изменение

Центр фондов предоставляет информацию о фондах, некоммерческих, корпоративных пожертвованиях, оценке и связанных с ними темах для грантодателей, соискателей грантов, исследователей, политиков, журналистов и широкой общественности через свои библиотеки, публикации и онлайн-сервисы.Этот проект анализирует полный набор приложений 100 & Change и отображает соответствующие им системы финансирования. Проект связывает участников 100 & Change с другими ресурсами, отражает приверженность программы 100 & Change справедливому, открытому и прозрачному процессу и является ключевым компонентом маркетинговых усилий программы.

2014 • 3 года

Центр Фонда (Центр) является центральным источником исчерпывающей информации об институциональной филантропии в Соединенных Штатах.Он предоставляет информацию о фондах, корпоративных пожертвованиях, оценке и связанных с ними темах для грантодателей, соискателей грантов, исследователей, политиков, журналистов и широкой общественности через свои библиотеки, публикации и онлайн-сервисы. Этот грант обеспечивает общую поддержку Центру, источнику информации о сборе средств, на который в равной степени полагаются как соискатели, так и грантодатели. Он также обеспечивает поддержку проекта IssueLab, проекта по сбору и обмену грантовыми продуктами, такими как оценки, отчеты об исследованиях, тематические исследования, краткие описания проблем, наборы инструментов, отчеты конференций, наборы данных и другие элементы, созданные при поддержке фондов и других доноров.

2013 • 9 месяцев • Укрепление американской демократии

В этом проекте будет представлена ​​информация о деятельности, которую фонды и их получатели грантов предпринимают для укрепления американской демократии и США.С. Политическая система. Он будет проводиться в рамках партнерства Фонда Риты Аллен, Корпорации Карнеги в Нью-Йорке, Фонда демократии, Фонда Уильяма и Флоры Хьюлетт, Фонда Макартуров, Фондов открытого общества и Фонда братьев Рокфеллер. Он ответит на такие вопросы, как: Кто основные спонсоры и на каких проблемах они сосредоточены? Кто основные получатели грантов? Кто помимо фондов является еще одним важным спонсором в каждой проблемной области? Как можно улучшить координацию или сотрудничество спонсоров? Центр Фонда разработает ответы на эти вопросы по тематике, спонсору, грантополучателю и географическому региону.Инструмент визуализации данных, который показывает отношения между спонсорами, получателями грантов, проблемами и географическими регионами, будет сопровождать окончательный отчет по проекту.

2011 • 3 года

Центр фондов является центральным источником исчерпывающей информации об институциональной филантропии в Соединенных Штатах.Основанный в 1956 году, Центр фондов предоставляет информацию о фондах, корпоративных пожертвованиях и связанных предметах грантодателям, соискателям грантов, исследователям, политикам, журналистам и широкой общественности через свои библиотеки, публикации и многочисленные сложные онлайн-сервисы. Этот грант поддерживает общую деятельность Центра Фонда.

2009 • 1 год

Для поддержки нового онлайн-инструмента картографии благотворительности.

2008 • 3 года

В поддержку общих операций (более трех лет).

2005 • 3 года

В поддержку общих операций (более трех лет).

2002 • 3 года

В поддержку общих операций (более трех лет).

1999 • 3 года

В поддержку общих операций (более трех лет).

1998 • 1 год

Для реализации нового дизайна базы данных.

1996 • 3 года

В поддержку общих операций (более трех лет).

1993 • 3 года

В поддержку общих операций, для проведения общественных услуг, исследований и издательских программ, разработанных для удовлетворения потребностей грантодателей и соискателей грантов, а также для содействия расширению знаний о благотворительности (более трех лет).

1990 • 1 год

Для поддержки общих операций.

1989 • 1 год 1 месяц • Журналистика и СМИ

Распространять фильм «Основы: люди и деньги.«

1987 • 4 года 1 месяц

Для поддержки государственных услуг и программ публикации (более пяти лет).

1987 • 1 год 1 месяц

Сделать документальный фильм о роли фондов в Америке.

1985 • 1 год

Для поддержки общих операций.

1984 • 1 год

Переместить головной офис и головной офис.

1984 • 1 год

Для поддержки общих операций.

1983 • 1 год

Для поддержки общих операций.

1982 • 1 год

В поддержку общих операций (более двух лет).

1981 • 1 год

Для поддержки общих операций.

1980 • 1 год

Для поддержки общих операций.

Вагинальный кандидоз | Грибковые заболевания

Около

Кандидоз — это инфекция, вызываемая дрожжевым грибком (разновидность грибка) под названием Candida . Candida обычно живет внутри тела (в таких местах, как рот, горло, кишечник и влагалище) и на коже, не вызывая никаких проблем. Иногда Candida может размножаться и вызывать инфекцию, если среда во влагалище изменяется таким образом, что способствует его росту. Кандидоз во влагалище обычно называют «вагинальной дрожжевой инфекцией». Другие названия этой инфекции — «вагинальный кандидоз», «кандидозный вульвовагинит» или «кандидозный вагинит».

Симптомы

Симптомы вагинального кандидоза включают: 1,2

  • Зуд или болезненность влагалища
  • Боль при половом акте
  • Боль или дискомфорт при мочеиспускании
  • Аномальные выделения из влагалища

Хотя чаще всего вагинальный кандидоз протекает в легкой форме, у некоторых женщин могут развиться серьезные инфекции, включая покраснение, отек и трещины на стенке влагалища.

Обратитесь к своему врачу, если у вас есть какие-либо из этих симптомов. Эти симптомы похожи на симптомы других типов вагинальных инфекций, которые лечат разными видами лекарств. Врач скажет вам, есть ли у вас вагинальный кандидоз и как его лечить.

Риски и предотвращение

Кто болеет вагинальным кандидозом?

Вагинальный кандидоз является распространенным явлением, хотя необходимы дополнительные исследования, чтобы понять, сколько женщин им подвержено. Среди женщин, которые более подвержены вагинальному кандидозу, находятся:

  • Беременны
  • Используйте гормональные контрацептивы (например, противозачаточные таблетки)
  • Болеют диабетом
  • Имеют ослабленную иммунную систему (например, из-за ВИЧ-инфекции или лекарств, ослабляющих иммунную систему, таких как стероиды и химиотерапия)
  • Принимаете или недавно принимали антибиотики
Как предотвратить вагинальный кандидоз?

Ношение хлопкового нижнего белья может снизить вероятность заражения дрожжевым грибком. 2 Поскольку прием антибиотиков может привести к вагинальному кандидозу, принимайте эти лекарства только по назначению и в точном соответствии с указаниями вашего лечащего врача. Узнайте больше о том, когда антибиотики работают, а когда их следует избегать.

Источники

По оценкам ученых, около 20% женщин обычно имеют Candida во влагалище без каких-либо симптомов. 2 Иногда Candida может размножаться и вызывать инфекцию, если среда во влагалище изменяется таким образом, что способствует его росту.Это может произойти из-за гормонов, лекарств или изменений в иммунной системе.

Диагностика и тестирование

Медицинские работники обычно диагностируют вагинальный кандидоз, беря небольшой образец выделений из влагалища для исследования под микроскопом в медицинском кабинете или отправки в лабораторию на предмет грибковой культуры. Однако положительный результат посева на грибок не всегда означает, что Candida вызывает симптомы, потому что у некоторых женщин Candida может находиться во влагалище без каких-либо симптомов.

Лечение

Вагинальный кандидоз обычно лечат противогрибковыми препаратами. 3 Для большинства инфекций лечение представляет собой противогрибковое лекарство, вводимое во влагалище, или однократную дозу флуконазола, принимаемую внутрь. Другие методы лечения могут потребоваться для более серьезных инфекций, которые не проходят или которые продолжают возвращаться после улучшения. Эти методы лечения включают прием больших доз флуконазола внутрь или других лекарств, вводимых во влагалище, таких как борная кислота, нистатин или флуцитозин.

Если вы медицинский работник, обратитесь по номеру:

Статистика

Вагинальный кандидоз — обычное дело. В Соединенных Штатах это второй по распространенности тип вагинальной инфекции после бактериальных вагинальных инфекций. 2 Приблизительно 1,4 миллиона амбулаторных посещений по поводу вагинального кандидоза ежегодно происходят в Соединенных Штатах. 4 Число случаев вагинального кандидоза в США неизвестно.

  1. Gonçalves B, Ferreira C, Alves CT, Henriques M, Azeredo J, Silva S.

Оставьте комментарий